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1 부 : 명확히 조직 homogenates의 작성
- 약 30도 유봉 스트로크로 (즉, 추가 400μl 버퍼 - 얼음처럼 차가운 버퍼 (플러스 2X 프로 테아제 억제제 칵테일 [산타크루즈] 0.1M 인산 버퍼 호수 [와 MG + + 무료 칼슘 + +])의 4 번 볼륨에서 수정되지 않은 대뇌 피질의 조직을 균질 다운스 100mg 조직).
- 3000 5 분 스핀 homogenates g (4 ° C). 조심스럽게 -80에서 명확히 supernatants 이들 추출물의 저장 aliquots를 제거 ° C를 사용까지.
- 제조 업체의 지침 (ThermoFisher)에 의하면, bicinchoninic 산성 (BCA) 분석을 사용하여 명확히 homogenates에 대한 총 단백질 농도 (μg / μl)를 결정합니다.
2 부 : SDS - PAGE 샘플 준비
- 물론 10으로 10~20% Tricine 젤 (Invitrogen), 잘마다 로드할 수있는 최대 볼륨 ~ 25μl이다. 총 볼륨 2X SDS 샘플 버퍼와 10X 감소 에이전트를 포함, 잘마다 로드할 수 명확히 homogenate의 최대 볼륨이 10μl가되도록. 20% (W / V) 명확히 피질 homogenates는 당 잘 50μg 총 단백질에 대한 허용, 5 μg / μl 이상의 총 단백질 농도가 있어야합니다. 이하 5mg/ml 단백질과 샘플 당 자 이하 총 단백질을 로딩 할거 것입니다. 그러나, 높은 단백질 수준은 monomeric 및 집계 Aβ의 검색 (50 - 60μg 총 단백질이 최적입니다)에 최적입니다.
항상마다 잘 총 단백질의 동일한 금액을로드합니다. - 각 젤 들면 SeeBlue Plus2 (Invitrogen)로 분자량 마커의 10μl와 적어도 하나를로드합니다. 긍정적인 제어로, 합성 Aβ40 또는 다른 우물에 Aβ42 펩타이드 (1xPBS에 희석) 10 - 100ng 실행합니다.
- 갓 해동, 명확히 homogenates을 사용하여 얼음에서 반응 혼합물을 준비합니다. 5-10초에 대한 소용돌이 튜브, 100에서 건조 욕조에 열을 ° C 5 분 후, 신속하게 모자의 결로를 제거하는 모든 샘플을 스핀.
파트 3 : SDS - PAGE 젤 전기 영동
- , 제조 업체의 지침 (Invitrogen)에 따라, Tricine SDS 실행 버퍼를 사용하여 XCell 물론 잠금 미니 셀 Gelbox에 10~20%의 Tricine 젤로 vortexed 샘플을로드
- 약 90 분 동안 125V의 일정한 전압에서 젤을 실행합니다. 4KDa 마커 밴드가 젤의 바닥에서 1cm에 대한 때까지 샘플을 실행하자.
4 부 : 젤에서 세포막으로 전송 단백질
- 조심스럽게 제조 업체의 지침 (Invitrogen)에 따라, 플라스틱 케이스에서 젤류를 제거하고 XCell II 얼룩 모듈 내부 전송 샌드위치를 조립. 사전 서부 유럽 표준시 트리스 - 글리신 전송 버퍼 (20 % 메탄올)과 패드와 0.2μm nitrocellulose 막을 모래 바닥, 그리고 모래 바닥 패드 또는 여과지 / 멤브레인 샌드위치에서 모든 거품을 제거하십시오.
- XCell Gelbox에서 전송 버퍼와 내부 챔버를 기입 dIH 2 O (메탄올의 노출 시간이 지남에 따라 플라스틱 gelbox을 입을 수)와 외부 챔버를 입력합니다.
- 25mA의 일정한 암페어에서 2~3시간에 대한 전송을 실행합니다.
- 전송이 완료되면, 샌드위치를 재조 두 사각형 플라스틱 배양 접시에 1xPBS (또는 다른 적절한 컨테이너)에 dIH 2 O와 점막에 젤 넣습니다.
- 단백질 전송의 효율성을 시각화하기 위해, 젤 단순히 블루 SafeStain (Invitrogen) 물들일 수 있으며, 개양귀비빛의 S 붉은 얼룩 (시그마 알드리치)와 안정, 두 제조 업체의 지시에 따라. 이 얼룩은 immunoblotting 영향을주지 않습니다. 얼룩은 비효율적인 단백질 전송을 공개하는 경우 3 단계에서 전송 시간을 수정합니다.
제 5 부. 항원 - 에피토프 복구 및 Immunoblotting
- 항원 검색은 immunoblotting 동안 항체 바인딩을위한 멤브레인에 Aβ epitopes을 드러내는에서 중요한 단계입니다. 100 일정한 온도를 유지 ° 모든 증기선, 전자렌지, 또는 물이 욕조가 C는 충분합니다. 기선의 항원 검색을 위해, 상온에서, 1xPBS 가득한 강력 Kapak 플라스틱 주머니에서 막을 열 - 인감. 미리 온수 기선의 평면 주머니 라이, 파우치는 추가로 15 분 동안 품어, 확장하기 시작 한때. 멤브레인가 과도하게 주름을 방지하기 위해, 주머니에서 제거하기 전에 천천히 냉각 수 있습니다.
- 상온에서, 신중하게 피어오르는 주머니에서 멤브레인를 제거하고 5 분 (0.05 % 트윈 - 20과 함께 살린, 산도 8.0을 트리스 버퍼 TBS - T에 린스 다음 1xPBS 5 분 동안 멤브레인을 린스 [시그마] ), 궤도 흔드는에. 떨고 한 시간 동안 차단 솔루션에 멤브레인 (TBS - T에서 2.5 %의 무지방 우유)를 품어. rinsing없이, 피하 풍선 (1:1,000 [1μg/ml] 1:5,000 [0.2μg/ml] 희석, Covance에서 6E10) 차단 솔루션에 희석 기본 항체를 포함하는 음식 또는 플라스틱 주머니에 막를 전송S. 4 떨고 ° C (더 이상 부화 더 나은 신호를 줄 수 있습니다.) 1 시간 후 24~48시간에 대한 실온에서 궤도 흔드는에 품어
- TBS - T 30 분 동안 막을 린스 (한 빠른 3 X 10 분 rinses 다음 린스).
- 상온에서 흔드는에서 90 분간 차단 솔루션 1:10,000에서 희석 HRP - 복합 이차 항체에 멤브레인 (애머스햄 ECL 양 안티 - 마우스, GE 헬스케어)을, 알을 품다.
- TBS - T 30 분 동안 막을 린스 (한 빠른 3 X 10 분 rinses 다음 린스).
- 흔드는에서 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 보푸라기가없는 필터 종이에 여분의 시약을 얼룩 및 필름 카세트에 막을 장소, 5 분 갓 만든 SuperSignal 웨스트 피코 Electrochemiluminescence 시약 (ThermoFisher)에서 막을 품어. 먼지없는 Kimwipes 필요한 경우와 추가 SuperSignal 시약을 얼룩.
- 30 분정도 30 초 간격에 대한 코닥 Biomax MR 필름에 노출 및 필름 개발에 개발할 수 있습니다. 오분 후, Aβ 모노머 밴드는 아마 포화됩니다.
- 세포막은 복원에 떨고 플러스 실온에서 30 분 버퍼가 벗겨진하고 원하는 경우 추가 항체와 reprobed하여 (TBS - T에 rinsing 이후) 송두리째 수 있습니다.
6 부 : 대표 Immunoblot :
7 인간의 과목에서 50μg 총 단백질을 포함하는 수치 1A - C. 명확히 homogenates는 multimeric Aβ와 APP의 존재에 대해 분석하고 있습니다. 항체 6E10와 Immunoblotting 것은 Aβ 단량체, dimers, trimers, tetramers, 그리고 알츠하이머의 경우 APP (상단 밴드)뿐만 아니라,이 광고의 경우에 풍부 고분자량 Aβ의 multimers를 보여줍니다. 합성 Aβ40은 낮은 분자량 밴드의 신원을 확인합니다. AD : 알츠하이머 질환, DLB : Nondemented 인간 (A) 30 분 필름 노출, (B) 5 분 필름 노출, (C) 30초 필름 노출 :. Lewy 기관, ND와 치매.