우리는 명확히 인간 대뇌 피질 homogenates, SDS - PAGE로 단백질 분리, 항원 검색 및 Aβ 펩타이드에 대한 항체와 immunoblotting의 준비를위한 기술을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 알츠하이머의 병리 현상과 인간의 대뇌 피질 조직에서 monomeric 및 multimeric Aβ를 감지합니다.
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방법 논문
인간의 두피 조직에서 Aβ Multimers의 SDS-PAGE/Immunoblot 감지는 항원 에피토프 검색을 사용 Homogenates
이 논문에서
요약
초록
β - 아밀로이드의 변칙 접지와 중합도 (Aβ) 펩타이드는 알츠하이머 질병 pathogenesis에 neurodegenerative 층계를 시작 생각됩니다
프로토콜
1 부 : 명확히 조직 homogenates의 작성
- 약 30도 유봉 스트로크로 (즉, 추가 400μl 버퍼 - 얼음처럼 차가운 버퍼 (플러스 2X 프로 테아제 억제제 칵테일 [산타크루즈] 0.1M 인산 버퍼 호수 [와 MG + + 무료 칼슘 + +])의 4 번 볼륨에서 수정되지 않은 대뇌 피질의 조직을 균질 다운스 100mg 조직).
- 3000 5 분 스핀 homogenates g (4 ° C). 조심스럽게 -80에서 명확히 supernatants 이들 추출물의 저장 aliquots를 제거 ° C를 사용까지.
- 제조 업체의 지침 (ThermoFisher)에 의하면, bicinchoninic 산성 (BCA) 분석을 사용하여 명확히 homogenates에 대한 총 단백질 농도 (μg / μl)를 결정합니다.
2 부 : SDS - PAGE 샘플 준비
- 물론 10으로 10~20% Tricine 젤 (Invitrogen), 잘마다 로드할 수있는 최대 볼륨 ~ 25μl이다. 총 볼륨 2X SDS 샘플 버퍼와 10X 감소 에이전트를 포함, 잘마다 로드할 수 명확히 homogenate의 최대 볼륨이 10μl가되도록. 20% (W / V) 명확히 피질 homogenates는 ....
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토론
알츠하이머 병 1,4,5의 pathogenesis에서 Aβ 집합의 중요성에도 불구하고, 몇 가지 연구가 설명 또는 인간의 대뇌 피질의 조직 샘플 2 다양한 Aβ multimers의 분포를 계량 있습니다. 일반적으로 사용되는 immunohistochemical 기법은 고정 피질 조직에서 서로 다른 multimeric Aβ 종의 차별에 대한 허용하지 않습니다. 떼어낸 피질 조직 homogenates에서 Aβ multimers는 분리와 화학적 겔 전기 영동과 항체 기반의 탐지 방법을 사용 평가하실 수 있습니다. 그러나, 타겟으로하는 Aβ epitopes는 감지 및 집계 Aβ의 정확한 양을 정함 방지, 집계 및 사후 translationally 수정 펩타이드 구조 내에 숨겨져있을 수 있습니다. SDS - PAGE와 Aβ 6,7의 N - 터미널 지역에 항체와 immunoblotting와 결합하여 열을 유발 항원 에피토프 검색을 사용하여, 우리는 별도의 자연 인간의 두뇌에서 격리.......
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감사의 글
일레인 Pranski 우수한 기술 지원 캐롤린 Suwyn와 해리 레빈 III, M. 폴 머피, 중요한 대화를 게어링 말라 많은 감사드립니다. 기금은 RR - 00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, 우드러프 재단과 에모리 대학 조사위원회에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Complete Protease Inhibitor Cocktail 정제 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 25ml 완충액당 정제 1알 |
| BCA Protein Assay 키트 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell 및 XCell II Blot Module 키트 CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS 샘플 완충액 (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE 샘플 환원제 (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitrocellulose 막, 0.2 μm 공극 크기 | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Running 완충액 (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glycine Transfer 완충액 (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 면역염색을 방해하지 않음 |
| ATX Ponceau S Red 염색액 | Sigma-Aldrich | 09276 | 면역염색을 방해하지 않음 |
| Kapak 열 밀봉 가능 플라스틱 샘플 파우치 | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| Aβ(1-16)에 대한 6E10 마우스 단클론 항체 | Covance | SIG-39320 | WB용으로 1:1,000에서 1:5,000까지 희석 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (sheep 유래) | GE Healthcare | NA931-1ML | 1:10,000으로 희석 |
| SuperSignal West Pico 화학발광 기질 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR 필름 | Carestream Health | 870 1302 |
참고문헌
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in n....
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