분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
내생 신진 대사 과정 중 또는 외인성 소스에 의해 유도된 아르 DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs)는, 게놈 무결성 생존과 보존에 관한 가장 중요한 DNA의 병변 중 하나입니다. DSBs의 유도에 초기 반응은 γH2AX을 형성, 높은 보존 C - 터미널 SQEY의 모티브에서 세린 - 139 잔여물에서 H2A 히스톤 변형, H2AX의 인산화입니다
프로토콜
셀 준비
- 37, 표피 성장 인자, 소 뇌하수체 추출물 및 20 μg / ML gentamicin과 보충 ° C와 5% CO 2; 인간 keratinocytes (FEP - 1811)은 (Invitrogen K - SFM) Keratinocyte - 세럼 무료 매체 성장했다.
- 단일 세포 현탁액은 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.05 % V / V)로 분리하여 준비했습니다
- 전지는 8 잘 연구실 테크 II microchamber 슬라이드에서 씨앗을 품고 있었다 (10,000 셀 / 음)과 슬라이드가 37 ° C와 5 % CO 2에서 3 일간 incubated되었습니다.
조사
- 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 20.6 초 / 쥐 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여이 쥐와 함께 얼음에 조사되었다
- Unirradiated 제어 및 2 쥐 조사 전지는 37 ° C와 5% CO 2에서 1 시간 동안 incubated되었습니다.
Immunofluorescence 염색법
- 미디어는 밀고되어 세포가 잘 당 PBS의 300μl (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)로 씻어 5 분 동안 궤도 믹서에 회전 하였다.
- 버퍼는 밀고와 paraformaldehyde 각 잘 추가되었고 슬라이드가 10 분 동안 상온에서 incubated 있었다 신선한 4퍼센트 (V / V)의 100μl했습니다.
모든 incubations은 humidified 얼룩 트러프에서 수행되었다 - 전지는 다음 PBS (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)로 세탁했다. 슬라이드가 5 분 궤도 믹서에 코플린 병 및 회전에 배치했다. 이 세척 단계는 더 이상 두 번 반복되었다.
- 버퍼 밀고했고 초과 PBS는 부드럽게 blotted되었습니다.
- 세포 100ml 트리톤 X - 100 (0.1 % V / V) 당 잘하고 실온에서 10 분 배양을 사용하여 permeabilized되었습니다.
- 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)와 같은 3 단계 이상 4 설명했다.
- 비 - 특정 단백질 바인딩은 상온에서 잘하고 이십분 부화 당 BSA의 100ml (1 % V / V)로 차단되었습니다.
- 초과 BSA는 밀고되었으며 기본 마우스 단클론 항 phospho - H2AX 히스톤 항체 (1 % BSA에 1:500 희석, Millipore)의 100μl는 상온에서 1 시간 배양 각 잘 추가되었습니다.
- 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +) 위의 3 단계와 4 단계에서 설명한 및 보조 항체의 100μl (알렉사 플루어 488 염소 방지 마우스 IgG와 incubated 1 % BSA에 1:500 희석 ; Invitrogen) 어둠 속에서 실온에서 45 분간 잘마다. (희석 항체가 절차를 통해 어둠에 보관되었습니다)
- 세포 PBS로 씻은했다 (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)와 같은 3 단계 이상 4 설명했다. 그러나, 빛에 노출 호일을 사용하여 최소화했다.
- 잘 따라와 실온에서 10 분 배양, 핵 counterstaining은 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 희석)으로 수행되었습니다
- 전지는 PBS (W / O 칼슘 2 + 또는 MG 2 +)가로 씻은 것처럼 위의 단계 10 설명했다.
- 챔버 스는 조심스럽게 슬라이드에서 제거되었습니다, 과잉 수분이 blotted되었고 슬라이드는 건조 공기를 허용되었다.
- GOLD 방지 퇴색 솔루션 (Invitrogen)를 연장 중 하나는 방울마다 잘 추가되었습니다과 슬라이드가 탑재되었다 (22x50 mm coverslip) 및 슬라이드의 가장자리 주위에 초과 액체는 blotted되었습니다.
- 슬라이드는 매니큐어로 밀봉하기 전에 실온에서 추가로 30 분 어둠에 보관했다.
- 슬라이드 4에서 하룻밤 저장된 ° C 분석하기 전에 어둠 속이라서.
현미경 / 분석
- (- 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 IgG γH2AX)과 멀리 붉은 레이저 (TOPRO - 3) 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 Microscpe은 표준 GFP를 사용하여 이미지를 획득하는 데 사용됩니다. 일반적으로 63 X 오일 침지 객관적인 렌즈가 사용됩니다.
이미지는 0.5 μm의의 스텝 크기와 Z - 시리즈 패턴에 인수됩니다. 0.5 μm의의 단계 크기는 핵에서 다른 비행기에 foci 선물의 손실을 최소화하기 위해 선정되었습니다. 분석하는 동안, 개인 비행기는 deconvoluted 및 foci의 중복 (톱 - 모자 필터 적용)를 최소화하기 위해 최대 예상 이미지를 생산하기 위해 정렬됩니다. - Metamorph (분자 디바이스, 미국)는 foci의 개수를 분석하는 데 사용되었다.
임계값이 배경을 제외 적용된 후이 프로그램은 각 셀에 foci의 수를 quantitates. 이 정보는 추가 분석을 위해 Microsoft Excel 스프레드 시트에 기록됩니다.
그림 1. 치료 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO 2. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 이미지 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 바 = 10 μm의.
그림 2. 인간 keratinocytes에서 2 쥐와 조사 37에서 추가로 1 시간 동안 incubated 세포 γH2AX foci (녹색)의 Immunofluorescence 시각화 ° C 5 % CO 2. 이미지는 모든 foci가 인수되었습니다 보장하기 위해 0.5 μm의 Z - sectioning (1-9)를 사용하여 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 현미경을 사용하여 인수했다. 이미지는 다음 Metamorph를 사용하여 quantitation 위해 쌓아했다. DNA는 TOPRO - 3 (블루) 물들일했습니다. 스택 γH2AX 및 파랑 이미지는 시각화를 위해 쌓아되었습니다. 바 = 10 μm의.
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토론
이온화 방사선 (γ 선), 빠르게 γH2AX foci 양식 및 foci 번호를 다음 노출 30~60분 2 사이 최대에 도달. 따라서, 우리 1시간 후 방사선 시점은 초기 DSB 형성을 반영합니다. 우리는 우리의 실험 2 쥐의 임상 관련 방사선 선량을 사용했습니다. 그러나 방법은 초기 DSB 형성의 검출 4 쥐 위해 방사선 접종에 사용할 수있는, foci 상당한 중복 높은 복용에 정확한 quantitation 걸로. γH2AX foci가 같지는 숫자 결과, 수리로 인한 손실로 높은 방사선 접종은 더 후 방사선 배양 시간에 사용할 수 있습니다. 일반적으로, 최대 24 시간 후 방사선 배양 시간 4시간하며 모니터링 DNA의 수리를 위해 사용됩니다. 우리는 DNA가 우리 공촛점 현미경의 여기 레이저의 제한 TOPRO - 3으로 인해 스테인 사용하고 있습니다. 더 일반적으로, 4,6 - diamidino - 2 - phenylindole의 dihydrochloride (DAPI)는 핵 counterstaining...
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. LM은 멜버른 연구 (멜버른 대학)와 바이오 메디컬 이미징 CRC의 보조 장학금으로 지원됩니다. 모나 마이크로 이미징의 지원 (DRS 스티븐 코디 Iśka 카마 이클)이 작품 소중한했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| Keratinocyte-Serum Free Medium (K-SFM) | 배지 | Invitrogen | 17005042 | 인간 재조합 Epidermal Growth Factor 1-53 (EGF 1-53) 및 Bovine Pituitary Extract (BPE)가 첨가된 각질세포 배지. |
| Lab Tek lI Chamber Slides (8-well) | 챔버 슬라이드 | Nalge Nunc international | NUN154534 | |
| 커버슬립 (22x50mm) | 커버슬립 | Menzel-Glaser | CS2250100 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 BSA (1%)를 사용함. 1차 및 2차 항체는 BSA에 희석함. | |
| PBS (Ca2+ 및 Mg2+ 제외) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| 0.5% Trypsin-EDTA x10 | Invitrogen | 15400-054 | 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 Trypsin-EDTA (0.05%)를 사용함. | |
| Triton X-100 | 시약 | Sigma-Aldrich | T8787 | 세포 투과화를 위해 Triton X-100 (0.1%)을 사용함. |
| Paraformaldehyde | 시약 | Sigma-Aldrich | 158127 | 세포 고정을 위해 Paraformaldehyde (4%)를 사용함. |
| Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX 항체 | 1차 항체 | EMD Millipore | 16193 | 1% BSA에서 1차 항체 희석 (1:500). |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | 2차 항체 | Invitrogen | 11029 | 1% BSA에서 2차 항체 희석 (1:500). |
| TOPRO3 | DNA 염색제 | Invitrogen | T3605 | 흔히 사용되는 DNA 염색제: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). 적절한 여기 레이저가 장착된 현미경에서만 사용 가능함. |
| ProLong Gold | 항퇴색 용액 | Invitrogen | P36930 | 20°C에서 굴절률 1.42. |
| 조직 배양 플라스크, 통기성 캡 | 배양 플라스크 | BD Biosciences | 353112 | |
| 조직 배양 접시 (150x25mm) | 페트리 접시 | BD Biosciences | 353025 | |
| 코플린 자(Jar), 유리제 | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| 염색 트러프 | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Gammacell 1000 Elite Irradiator | 감마 조사기 | Nordion International Inc. | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | 공초점 현미경 | |||
| Metamorph | 이미지 분석 소프트웨어 | Molecular Devices |
참고문헌
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M. Gamma H2AX and cancer. Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).
- Savic, V. Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin. Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).
- Downs, J. Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites. Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).
- Chowdhury, D. [gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair. Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).
- Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint. EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).
- Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes. Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).
- Kusch, T. Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions. Science. 306, 2084-2087 (2004).
- Hurlin, P. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).
- Dickey, J. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. , Forthcoming (2009).
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