현미경 coverslips에서 포유 동물 세포의 현장 subcellular 분별 (분리)에서 단백질 지방화의 시각이 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
단백질 기능을 속속들이 단백질 현지화로 결합됩니다. 어떤 단백질은 특정 위치 또는 subcellular 구획로 제한하고 있지만, 많은 단백질이 밀접하게 특정 subcellular 도메인 또는 구조와 관련된 하위 인구를 무료로 교환 자유롭게 diffusing 인구로 존재한다. 원위치 subcellular 분별 (분리)에서의 시각화가 가능 단백질 compartmentalization 또한 단백질 구체적인 구조에 집중 하위 인구를 공개하실 수 있습니다. 예를 들어, 용해 세포질 단백질과 느슨하게 개최 핵 단백질의 제거는 염색질와 함께 전사 요소의 안정적인 연결을 확인할 수 있습니다. DNA의 소화 이후 어떤 경우에는 집합 핵 발판이나 핵 매트릭스를 칭했다는 단백질과 RNAS의 네트워크 연결을 확인할 수 있습니다.
여기 현미경 coverslips에 자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 분별화에서 중 필요한 단계를 설명합니다. 단백질 시각화는 특정 항체 또는 형광 융합 단백질과 형광 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 항체 및 / 또는 특정 구획이나 구조에 대한 마커 역할을 형광 염료는 단백질 지방화는 자세히 매핑 될 수 있습니다. 원위치 분별화에서도 서양 각 분획에있는 단백질의 양을 비교 모래 바닥과 함께하실 수 있습니다. 이 간단한 생화 학적 접근 방법은 별도로 들키지 않고 남아있는 것이 연결을 확인할 수 있습니다.
프로토콜
분류에 대한 I. 준비
이 섹션은 폴리 - L - 라이신 코팅 현미경 coverslips 및 분류하기 전에 세포의 첨부 파일의 준비를 설명합니다. 필요한 경우 전지 transiently 첨부 앞 또는 뒤에 하나 단백질 발현 벡터와 함께 transfected 수 있습니다.
폴리 - L - 라이신 코팅 coverslips의 A. 준비
- 증류수에 1mg/ml 폴리 - L - 라이신의 솔루션을 준비합니다.
- 22 락을 플랫폼에서 최소한 1 시간 동안 솔루션에서 그들을 잠복기로 폴리 - L - 라이신과 겉옷 깨끗한 coverslips ° C.
- 두 멸균 증류수로 코팅 coverslips를 씻고 96 % 에탄올과 함께 하나의 세척과 함께하십시오.
- 에어 필터 종이에 코팅 coverslips을 건조하고 나중에 사용할 수 드라이 컨테이너 (일단 드라이들은 스택 가능)에 보관하십시오.
coverslips에 B. 첨부 세포
비 점착 성의 세포 (여기서 우리는 K562 세포를 사용)
- 최대 직면한 코팅 표면을 가진 6....
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토론
일반적인 문제 및 제안 :
전부 또는 세포의 대부분은 세척하는 동안 손실됩니다. 세척 단계를하는 동안 액체는 coverslip을 피하 6 잘 접시의 측면으로 천천히 추가해야합니다. 마찬가지로 액체는 신중하게 틸팅 판에 의해 제거되어야하며 천천히 초과 액체를 pipetting. 세포 접착은 폴리 - L - 라이신 코팅 coverslips을 사용하여 증가 수 있습니다.
게놈 DNA가 완전히 소화하지 않습니다. 몇몇 세포 유형에 대한 DNAse I의 소화 단계는 게놈 DNA의 완전한 제거를 달성하기 위해 확장 및 / 또는 DNAse I의 농도가 증가해야 할 수 있습니다.
고정 및 분획화 유물. 어떤 단백질은 고정 또는 분별화 6 중 relocalize 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 예를 들어 핵 막의 핵심의 다음과 같은 장애에서 발표 단백질은 달리 잘 구분된 구.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
Anyaporn Sawasdichai 및 Nazefah 압둘 하미드는 박사에 대한 각각 로얄 태국 정부와 말레이시아 정부에 감사 장학금. 이 작품은 PSJ와 KG에게 수여 웰컴 트러스트 프로젝트 부여하여 자금을했습니다. 우리는 또한 브리스톨 울프슨의 Bioimaging 시설의 대학에 감사하고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |
|---|---|---|---|---|
| BSA | 화학 물질 | Sigma-Aldrich | A9647-100G | |
| DNase I | 화학 물질 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| poly-L-Lysine | 화학 물질 | Sigma-Aldrich | P-8920 | |
| Trypsin | 화학 물질 | |||
| EGTA | 화학 물질 | Sigma-Aldrich | E4378-25G | |
| Fomaldehyde | 화학 물질 | VWR | 284216N | |
| PIPES | 화학 물질 | Sigma-Aldrich | P-6757 | |
| Sucrose | 화학 물질 | Fisher Scientific | S/8600/53 | |
| Triton X-100 | 화학 물질 | Sigma-Aldrich | T-6876 | |
| DAPI 함유 마운팅 용액 | 화학 물질 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Fugene 6 형질전환 시약 | 화학 물질 | Roche Group | 11814443001 | |
| Histone H1 | 항체 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-8030 | |
| Lamin A/C | 항체 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-20681 | |
| Tubulin-α | 항체 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-32293 |
참고문헌
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin. J Virol. 81, 4338-4342 (2007).
- Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S.
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재인쇄 및 허가
