우리는 사전 microRNA의 설정 및 분석 서비스를 선보일 예정 써모 과학 매트릭스 멀티채널 피펫과 수작업으로뿐만 아니라 로봇을 사용하여 QPCR위한 96 잘 배열.
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방법 논문
정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
정량 실시간 PCR (QPCR)는 유전자 발현 수준을 프로 파일링의 정확하고 가치있는 도구로 떠오르고있다. 의 많은 장점 중 하나는 각각의 분석에 대한 입력의 작은 금액을 사용하는 동안 유전자 발현 프로 파일링의 다른 방법에 비해 낮은 검출 한도입니다. 자동 qPCR 설정은 큰 재현성에 대한함으로써이 분야를 개선했다. 의 편리하고 신속한 설치는 각 실험에 동시에 여러 유전자의 프로 파일링을 지원, 높은 처리량 실험 수 있습니다. 내부 플레이트 컨트롤과 함께이 방법은 다른 기술에 공통 실험 변수를 감소시킵니다. 우리는 최근 186 프라이머 쌍 집합을 사용하여 사전 microRNAs의 프로 파일링을위한 qPCR 분석을 (사전 miRNAs) 개발. MicroRNAs는 포스트 transcriptional 수준에서 많은 mRNA 목표를 조절하는 능력을 가지고 작은 비 코딩 RNAS의 소설 클래스로 등장했습니다. 이러한 작은 RNAS 먼저 다음 miRNA 전구체 (미리 miRNA)로 죽습니다 기본 miRNA (PRI - miRNA) 성적표로 RNA 중합 효소 II에 의해 베꼈는데 있습니다. 사전 miRNAs는 주사위 놀이를하는 사람이 성숙한 miRNAs를 얻을 수있는 헤어핀 루프를 클리브스 세포질에 수출하고 있습니다. miRNA 수준의 증가가 유용할 수 있습니다 이러한 형태의 모두의 전구체와 성숙한 miRNA 수준 및 프로 파일링 모두에서 볼 수 있습니다. 성숙한 miRNAs에 대한 몇 가지 상용 assays가되지만, 높은 비용이 프로 파일링 기법에서 연구원을 억제 수도 있습니다. 여기서 우리는 사전 miRNAs을 프로파일 링의 비용 효율, 신뢰성, SYBR 기반 qPCR 방법을 논의합니다. 사전 miRNA 수준의 변화는 종종 성숙한 miRNA 변경 사항을 반영하고 성숙한 miRNA의 표현의 유용한 지표 수 있습니다. 그들이 nonredundant 정보를 기여하고 microRNA 처리에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다 그러나, 사전 miRNAs과 성숙한 miRNAs 모두 동시 프로파일 최적의 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 기술은 특정 경로 또는 병원균에 대한 다른 라이브러리 세트의 프로파일을 망라하는 확장하실 수 있습니다.
프로토콜
완전히 Tecan 자유 에보 (Evo) 로봇 (A) 또는 매트릭스 전자 멀티채널 피펫 (B)와 함께 손으로 자동으로 qPCR 사전 miRNA 프로 파일링 배열을 설정할 수 있습니다.
1) 마스터 믹스, 프라이머의 접시와 샘플을 준비합니다.
- 오후 12시 5분에서 96 - 웰 형식 (2 접시의 전체)에 186 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머의 플레이트는 -80 ° C.에 보관해야 실내 온도, 소용돌이 및 사용하기 전에 원심 분리기의 간략에서 해동 플레이트 아웃.
- 마스터 믹스를 준비하려면, 실온에서 SYBR 그린 2X PCR 믹스를 누그 러 뜨 리다. 각 반응은 2ul 입문서로 8ul 마스터 믹스를 사용합니다. 반응 당 마스터 믹스의 구성은 4ul SYBR 믹스, 3ul PCR 등급 물 10-20 NG 샘플 DNA 또는 cDNA입니다.
- 각 96 - 웰 플레이트 뇌관의 설정을 위해, 넷 마스터 믹스 튜브가 필요합니다. 샘플은 접시 당 4 샘플 (singlicate), 2 플레이트 당 샘플 (중복) 또는 네 겹의에서 하나의 샘플을 실행할 수 있습니다.
- 4 2ml Eppendorf 튜브의 각 SYBR, 물 샘플을 결합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 각각의 튜브는 폐기물을 pip....
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토론
QPCR는 매우 민감한 연구에 샘플 사이의 유전자 발현 수준을 비교하는 데 사용할 수있는 분석뿐만 아니라 바이러스의 경우에는 양성을 결정하는 것입니다. qPCR 배열을 사용하는 장점은 짧은 기간의 각 샘플에 대해 많은 primers를 (우리의 경우, 186 프라이머 쌍)를 실행하는 능력입니다. 같은 Tecan 자유 에보 (Evo), 최대 더욱 줄일 수있는 실험을 설정하는 데 필요한 시간의 양을, 그리고 로봇의 정확성과 일관성으로 pipetting 로봇을 사용하면 pipetting 오류를 줄이고 제거할 수 있습니다. 여기서 우리는 microRNA 배열뿐만 아니라 pipetting 로봇에 액세스할 수 없습니다 실험실에 대해 구현할 수 매트릭스 전자 멀티채널 피펫을 사용하여 다른 방법을 설정하는 Tecan 자유 에보 (Evo)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 모든 유전자가 반응의 비용과 전화 번호를 줄이는 같은 접시에서 실행 참조 유전자의 단일 집합을 정상화 수 있기 때문에 qPCR 배열도 유용합니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 DE018304, R01DE018281에 의해 지원되었다. KT는 T32 GM07092 - 34으로하고 그래드 이니셔티브에 클럽메드를 통해 하워드 휴스 의학 연구소 (HHMI)에서 채플 힐에서 노스캐롤라이나 대학에 부여에 의해 지원됩니다. PC는 T32 CA009156에 의해 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Freedom Evo 150 | Tecan Group Ltd. | 30017587 | |
| Matrix 전자식 멀티채널 피펫 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2001-MTX | (또는 위에서 설명한 부피를 분주할 수 있는 Thermo Scientific의 유사한 멀티채널 피펫) |
| Matrix Integrity 필터 팁, 멸균 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7435 | (또는 사용된 멀티채널용 유사한 팁) |
| Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master | Roche Group | 04 707 516 001 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Group | 05015243001 | 384-well 버전 |
| Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche Group | 04729749001 | |
| LightCycler 480 실링 포일 | Roche Group | 04729757001 | |
| LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software | Roche Group | 05075122001 | |
| Eliminase 오염 제거제 | Decon Laboratories | 04-355-31 |
참고문헌
- Bustin, A. A. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Frégeau, C. J. Automated....
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재인쇄 및 허가
