시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 망막 신경절 세포의 90 퍼센트 (RGCs)은 누구의 axons 완전히 axotomy 후 14 일 이내에 죽는 (axotomy) 그었 있습니다. 이 모델은 실험 조작을 쉽게받을 수있는 고도 재현할 수 있습니다.
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방법 논문
시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
망막 신경절 세포 (RGCs)는 CNS의 뉴런되는 시신경을 통해 뇌로 망막의 출력 영상 정보. 시신경은 안구의 궤도 내에서 액세스하고 완전히 전체 인구의 RGC axons를 절단 (axotomized) 그었 수 있습니다. 시신경의 절개면은 성인 CNS 1-4에서 apoptotic 세포의 연결을 죽음의 재현성 모델입니다. 눈 유리체 챔버가 intraocular 주사를 통해 실험 조작을 허용, 망막에 약물 전달 캡슐 역할을하기 때문에이 모델은 특히 매력적입니다. 유리 체액을 통해 화학 물질의 확산들은 전체 인구 RGC에 따라 행동을 보장합니다. 또한, RGCs은 선택적으로 그들의 목표는 우수한 colliculus 8로 시신경 5-7 또는 주입 벡터의 컷 끝에 짧은 방해 RNAS (siRNAs), plasmids, 또는 바이러스성 벡터를 적용하여 transfected 수 있습니다. 이것은 연구자들이 다른 방관자의 뉴런이나 주변 glia에 혼란함을 주죠 효과없이 원하는의 연결 인구 apoptotic 메커니즘을 공부하실 수 있습니다. 추가 혜택 세포 생존이 부상 후 계량 할 수있는 쉽고 정확성이다. 망막은 평평 계층 조직이며 RGCs는 내면 레이어, 신경절 세포 레이어에 현지 있습니다. RGCs의 생존은 axotomy 시에 시신경의 절단 끝에 형광 추적기 (3 % Fluorogold)을 적용하여, 또는 우수한 colliculus (RGC 대상)하기 전에 일주에 추적기를 주사하여 시간이 지남에 따라 추적할 수 있습니다 axotomy. 추적기는 retrogradely 전체 RGC 인구 라벨, 수송이다. 신경절 세포 레이어가 monolayer (두꺼운 한 셀)이기 때문에 RGC 밀도는 stereology 필요없이, 평면 장착 조직에서 계량하실 수 있습니다. 시신경의 절개 14 일 postaxotomy 9-11 이내에 부상 RGCs의 90 %의 apoptotic 죽음에 이르게한다. RGC apoptosis는 세포 죽음은 세포가 빠르게 타락한 이후 3~4일의 postaxotomy을 지연 의하여 시간 코스 특성이 있습니다. 이것은 apoptosis에 관련된 경로에 대한 이동 실험 조작을위한 시간 창을 제공합니다.
프로토콜
1. 외과 기술
- 실험 무균 기술을 사용하여 특정 기관의 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하여야한다. 살아있는 조직과 접촉으로 오는 악기와 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘 등) 동물 복지 및 연구에 대한 잠재적인 부정적 영향에 감염하고 불리한 영향을 방지하기 위해 멸균해야합니다.
2. 마취
- 쥐 한 동물 isoflurane 기화기 시스템을 사용 anaesthetized 것입니다. 0.8 L / isoflurane 가스를 기화하는 분의 비율로 의료 학년 산소를 사용하십시오. 첨부된 마취 상자에 동물을 배치하고 호흡이 둔화하고 있으며 동물이 진정 될때까지 4퍼센트의 isoflurane 농도에 전화.
- 다음, stereotaxic 프레임 가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 스위치와 stereotaxic 장치에 동물을 놓으십시오. 2 % isoflurane 농도를 켜고 마취를 모니터링합니다. 큰 동물 (> 300g)는 isoflurane의 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. 마취는 수술 중에 모니터링하고 isoflurane 복용량이 적절하게 조정해야합니다. 깊이와 호흡 속도는 지속적으로 평가해야하고, 깊은 고통의 부재에 대한 발가락 핀치 평가 (매 5 분)을 수행하여야한다....
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토론
이이 수술의 많은 변형이 있고이 프로토콜의 단계에 몇 가지가 필요하지 않습니다. 단지 신경에 액세스하기 위해서는 시신경을 ... 위에 가로 눕다 근육을 철회할 필요가 있습니다. 그러나, 신경 주위에 매우 제한된 작업 공간이 결과는 절개의 중요한 마지막 단계 더 어렵게 만듭니다. 어떤 상황에서는 그것은 시신경 스텀프에서 세포와 extraocular 근육과 lacrimal 선의이 인스턴스에서 유용합니다 retracting하여 여유 증가 액세스 공간을 transfect하는 것이 바람직하다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 단계 4.3-4.6입니다. 시신경의 머리 주위 vasculature을 손상하지 않는 것이 중요합니다. 신경은 안쪽 망막에 눈 및 피드 혈액 mm 하나에 신경을 침투 안과 동맥에 손상을 방지하기 위해 안구 뒤쪽 1.5-2.0 mm을 가로로한다. 따라서 안과 동맥 눈 손상의 뒤쪽에서 작은 작동 거리를 유지하여 피할 수 있습니다. 망막은 일반적으로 투명하고 혈관이 명확.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 정위 고정 틀 | Stoelting Co. | ||
| 쥐용 가스 마스크 | Stoelting Co. | ||
| 마취 시스템 | VetEquip | 901806 | |
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Internationl Inc. | DIN 02225875 | |
| 수술용 현미경 | WPI, Zeiss, Leica | ||
| Fluorogold -(Hydroxystilbamidine bis(methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| Gelfoam | Pharmacia Corporation (Pfizer) | ||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | ||
| Proviodine | Medline Industries | MDS093945H | |
| Vannas 스프링 가위 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine tip Dumont 핀셋 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 미세 수술용 훅 | Fine Science Tools | 10062-12 | |
| 안과용 드레싱 톱니 핀셋 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #7b 뾰족한 곡선형 톱니 핀셋 | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| 소작기 | Fine Science Tools | 18010-00 |
참고문헌
- Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular deter....
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