이 보고서에서 우리는 개발 신장의 줄기 / 전구 세포를 조절 신호 경로를 연구하는 데 사용할 수있는 배아 마우스 신장에서 전구 세포의 틈새의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이러한 교양 세포가 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 또한 중요한 후보 경로의 효율적인 조작을 허용 바이러스 전달에.
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이 논문에서
요약
초록
신장의 배아 개발 광범위 organogenesis의 상피 - mesenchymal 상호 작용을위한 모델로하고 선천성 신장 질환의 기원의 이해를 얻기 위해 두 연구되었습니다. 최근 nephrogenic 운명 향해 순진한 배아 줄기 세포를 핸들의 가능성은 재생 의학의 새로운 분야에서 살펴되었습니다. 마우스의 유전자 연구가 신장 개발에 필요한 몇 가지 경로를 파악해야하고, 장기에서 유전자 전사의 글로벌 카탈로그는 최근 생성되었습니다 http://www.gudmap.org/을 필수 발달 기능의 수많은 후보 레귤레이터를 제공합니다. 쥐 신장의 Organogenesis는 장기 문화를 공부 할 수 있으며, 여러 보고서 중 후보 단백질을 적용하거나 siRNA 또는 morpholinos를 사용하여 후보 유전자의 표현을 쓰러뜨린의 결과를 분석하기 위해이 방법을 사용했습니다. 교양 장기 macromolecules 및 바이러스 입자의 소형 세포외 기질 제한 확산을 포함 그러나 개발 신장에 줄기 / 전구 세포의 차별 대 갱신을 조절 신호의 연구 기관 문화의 적용이 제한됩니다. 우리가 분화의 상피 유도에서 격리 개발 신장 전의 생체내의 nephrogenic 영역 또는 전구 세포의 틈새를 수립 차 전지 시스템을 개발했습니다 신장에서 줄기 / 전구 세포의 틈새에 영향을 미치는 이벤트를 신호 세포를 연구합니다. 제한 효소 소화 사용 nephrogenic 영역 전지는 E17.5에서 신장을 개발로부터 해방 선택하실 수 있습니다. 여과 후,이 세포가 최적의 조건을 사용하여 불규칙한 monolayer로 교양 수 있습니다. 마커 유전자 분석은 이러한 문화가 생체내에 nephrogenic 영역의 특성 세포 유형의 분포를 포함하는 것을 보여줍니다, 그들은 문화의 기간 동안 적절한 마커 유전자 발현을 유지. 이 전지는 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 중요한 것은 역시 크게 후보 줄기 / 전구 세포 조절 효과의 연구를 용이하게 바이러스 전달에. 이러한 증식과 세포 죽음뿐만 아니라 생체내의 nephron의 줄기 / 전구 세포의 특성을 분자 마커의 표현의 변경과 같은 기본적인 세포 생물 학적 매개 변수가 성공적으로 실험 결과로 사용할 수 있습니다. 이 소설 일차 전지 기술을 사용하여 우리 연구실에서 진행중인 작업은 nephron의 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 대 분화의 규정을 관할 기본적인 메커니즘을 발견하는 것을 목표로하고있다.
프로토콜
1. 신장 소화를위한 시약 준비
- 0.25 %의 Collagenase 1.5 ML은 (W / V), 1 % Pancreatin 다이제스트 (W / V) 솔루션은 8 E17.5 신장에서 nephrogenic 영역 전지 (NZCs)의 추출에 필요한 것입니다. Pancreatin은 상온에서 분해하기 위해 약 2 시간이 소요되기 때문에 충분한 사전 실험되어야 예상 배아 신장의 최대 번호에 대한 솔루션을 소화. 첫번째 25 Collagenase의 MG 10 ML Dulbecco의 인산 분명 15 ML, 멸균 원심 튜브에 살린 (DPBS)를 버퍼 수 있습니다.을 추가하여 솔루션을 소화 준비 이것이 효소 소화에 영향을 줍니까로 DPBS이 칼슘이나 마그네슘을 포함하지 않는 것이 중요합니다. Collagenase A. 적어도 2 시간 해산 Collagenase nutator에 솔루션과 섞어 Pancreatin 100 MG 추가 해산 10 분 nutator에 솔루션을 섞는다. 또는, Collagenase A / Pancreatin 다이제스트 솔루션은 4 박 nutator에서 혼합 수 있습니다 ° C. 이것은 당신이 Collagenase와 Pancreatin은 무게 동안 대기 중으로 쉽게 분산과 비강을 짜증나게 수 있으므로, 마스크를 착용하는 것이 좋습니다.
- 행크의 버퍼....
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토론
이 프로토콜에서는 배아 신장의 nephrogenic 영역에서 세포를 분리하여 문화하는 방법을 설명합니다. 그것은 처음 nephrogenic 영역 (빈 외., 2009)의 세포에 BMP7 치료의 효과에 관한 연구의 일환으로 출판하는 방법의 개발이다. 초기 연구에서는 NZC 인구 내에서 대표 셀 유형을 특성화하기 위해 일련의 실험을 실시했다. (스리 니 바스 외, 2001.; 유 외를, 간단히, 대뇌 피질의 기질 (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini 외, 1996)에 대한 유전 기자의 NZCs의 정화는 (R26 rEYFP Hoxb7 + / CRE) 덕트 수집. , 2002), 그리고 모자 mesenchyme이 (Bmp7 + / lacZ) (고딘 외., 1998) 수확 NZCs의 약 35 %가 대뇌 피.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIDDK (LO), 미국 심장 협회 (AB), 스웨덴 및 Kungliga Fysiografiska Sällskapet, 룬드, 스웨덴 (UB)의 웬너 - Gren기구에서 박사 후 장학금에서 R01 DK078161에 의해 지원되었다. 추가 지원은 조직 병리학, 생물 정보학 및 외과를위한 메인 메디컬 센터 연구소의 핵심 시설 (2P20RR18789 - 06 지원)와 MMCRI 동물 시설에 의해 제공되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시계 제조공’포셉 #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2쌍 필요 |
| 콜라게나제 A | 로슈 그룹(Roche Group) | 10 103 578 001 | 마스크를 착용하십시오. |
| 돼지 췌장 효소제 | Sigma-Aldrich | P8096 | 마스크를 착용하십시오. |
| Ca, Mg 포함 DPBS | Lonza Inc. | 17-513F | Mg 함유 & Ca |
| 우태아혈청 (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| 헨克斯 평형염 용액 (HBSS) | Life Technologies의 GIBCO | 14175 | |
| KSFM | Life Technologies의 GIBCO | 10724-011 | 성장 인자를 추가하지 않은 상태에서 |
| L-글루타민 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | 1% v/v 농도로 사용하십시오. |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | 1% v/v 농도로 사용하십시오. |
| 피브로넥틴 | BD Biosciences | 356008 | 분말 형태로 공급됨 |
| 24웰 배양 플레이트 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| Mg가 포함되지 않은 DPBS & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL 폴리스티렌 튜브 | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μ1.5 ml당 l |
| 40 마이크론 세포 스트레이너 | BD Biosciences | 352235 | 캡 및 튜브 포함 |
| 파라포름알데하이드 | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % w/v 농도로 사용하십시오. |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | 0.3% v/v 농도로 사용하십시오. |
| 인산완충식염수 | Sigma-Aldrich | P3813 | 분말 형태로 제공됨 |
| 당나귀 혈청 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 5 % v/v로 사용하십시오. |
| 토끼 항-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | 1:100으로 희석하십시오. |
| 토끼 항-β-갈(gal) | MP Biomedicals | 559762 | 1:200으로 희석하십시오. |
| Oregon Green 488 팔로이딘 | Invitrogen | O7466 | 1:200으로 희석하십시오. |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | 1:200으로 희석하십시오. |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:5000으로 희석하십시오. |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 글리세롤 | EMD Millipore | GX0185-6 | H와 50% 비율로 혼합하십시오.2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | 용도 "컬럼 내 DNase 처리" 프로토콜 |
| 전달 피펫, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
참고문헌
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P.
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재인쇄 및 허가
