이 비디오에서는 마우스 thymic 림프종 세포 라인을 확립 프로토콜을 보여줍니다. 및 p53의 - / - - thymic 림프종과 생쥐이 프로토콜에 따라, 우리는 성공적으로 여러 ATM - /에서 T - 세포 라인을 설립했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
설립 세포 라인은 연구 실험 동물의 사용을 줄일 수있는 중요한 연구 도구입니다. 특정 같은 ATM과 같은 유전자 변형 생쥐의 변종 - / -와 p53의 - /이 - 일관되게 일찍 삶 1,2에서 thymic 림프종을 개발하고, 따라서, murine T - 세포 라인의 유도를위한 신뢰할 수있는 소스로 검색할 수 있습니다. 여기는 이전의 프로토콜 1,3에서 설명한 interleukins를 추가할 필요없이 설립 murine thymic T - 세포 림프종 라인의 개발을위한 세부적인 프로토콜을 제시한다. 종양은 hunched 자세의 관찰을 바탕으로 눈에 보이는 종양의 초기 표시에서 3~6개월 세 생쥐에서 수확 호흡, 가난한 정리하고 민감한 스트레인 1,4의 낭비를 보람 있었다. / - - [FVB/N- ATM tm1Led / J] 2 p53의 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 쥐가 우리는 성공적으로이 프로토콜을 사용하여 여러 개의 T - 세포 라인과 ATM의 근친 변종을 설립했습니다. 우리는 더 이상 기존 T - 세포 인구의 90 % 이상이 인 경우에는 3 번 CD, CD4와 CD8을 표현 것을 보여줍니다. 안정 설립 세포 라인과 일치, 현재 프로토콜을 사용하여 발생하는 T - 세포는 일년 이상 passaged되었습니다.
프로토콜
1. 종양의 해부
- 종양 절개 들어, 깨끗한 종이 타월이나 일회용 외과 드레이프는 해부 패드에 위치하고 있으며 70 %의 에탄올로 뿌렸어요.
- 이 프로토콜에 대한 생쥐가 일상적으로 CO 2 euthanized 있습니다. 절개 패드에 euthanized 마우스를 놓고 에탄올과 동물의 양쪽을 스프레이. 마우스는 다리를 통해 삽입 70 % 에탄올로 철저하게 뿌려놓은 4 개 이상의 푸시 핀을 사용하여 절개 패드에 장소에서 개최됩니다.
- 정중선을 통해 피부는 기본 근육을 피하와 본문 충치에 관통하면서, 멸균 가위를 사용하여 치골에서 머리의 기본으로 들어가있다.
- 무균 가위와 내부 장기를 손상하지 않도록주의하는 포셉의 새로운 쌍을로 복강을 엽니다.
- 해부 및 손상 혈관없이 종양을 나타내기 위해 갈빗대을 왜곡하여 흉강을 엽니다.
- 다른 장기에서 종양을 분리하고, 차가운 PBS로 작품 전체 종양의 약 40~50%를 (약 최대 1.5 X 0.8 X 0.8 cm) 전송 얼음이 있었죠.
- 종양의 나머지 부분은 다른 assays 저장 수 있으며 완벽한 검시이 시간에 수행할 수 있습니다.
2. Culturing의 림프종 세포
- 70 % 에탄올과 biosafety 캐비닛에 전송으로 해부하는 종양을 포함하고있는 튜브를 스프레이.
- 멸균 150mm 2 페트리 접시에 배지 10 ML을 추가합니다.
- 피펫과 부드러운 흡입하여 페트리 접시에 종양의 조각을 전송합니다.
- beveled 측면을 마주보고 두 멸균 18 게이지 바늘을 구부.
- 벤트 바늘을 사용하여 종양을 떼어 놓다.
- 소용돌이 접시를 부드럽게 탭 및 종양의 큰 조각을 피하면서, 측면에 세포 현탁액을 수집하는 각도로 놓으십시오.
- 종양의 큰 조각을 피하면서 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액과 전송 대기음.
- 종양의 큰 조각을 피하는 동안 같은 튜브에 매체 및 전송의 10 ML과 접시를 씻으십시오.
- 부드럽게 lymphocytes와 stromal 세포로 구성된 세포 현탁액을 혼합하고 T - 75 조직 배양 플라스크에 T - 25 조직 문화 플라스크 10 ML에 5 ML을 전송하기만하면됩니다. 부드럽게 소용돌이 flasks합니다.
- 2.5 ML 최종 볼륨 (문화 선박의 여러 유형을 사용하여 서로 다른 밀도에 culturing 세포 T 세포 라인을 확립 가능성을 극대화) 2, 4, 10100 1000 배 dilutions를 만들기 위해 나머지 세포 현탁액을 사용합니다.
- 6 잘 접시의 각각의 우물에 각 희석의 플레이트 2.0 ML. 부드럽게 소용돌이 접시합니다.
- 공기 humidified CO 2 분위기에서 48 H에 대한 세포를 품어.
3. 림프종 세포를주고
- 부화 48 H 후, 세포의 최소한의 방해와 벽 함께 T - 75 플라스크에 T - 25 플라스크와 매체의 10 ML 중간의 5 ML를 추가합니다.
- 세포의 최소한의 방해와 벽을 따라 6 잘 플레이트의 각 물론 중간 2 ML을 추가합니다.
- 추가 72 H.에 대한 세포를 품어
4. 림프종 세포를 Passaging
- 초기 통로
- 원래 flasks 및 접시 (첫 번째 구절 중에 약 3x106 / ML의 농도에서 세포 밀도를 유지의 성공적인 구축을 촉진 유지하면서 부화의 다섯 번째 하루의 끝에서, 세포는 1:1 비율로 passaged 아르 연속 세포주).
- T - 25 플라스크의 경우, 매체의 5 ML을 포함하는 새로운 플라스크에 세포 현탁액의 5 ML을 전송. 원래 플라스크에 매체의 5 ML을 추가합니다.
- T - 75 플라스크 들어, 중간의 10 ML을 포함하는 새로운 플라스크에 세포 현탁액의 10 ML을 전송. 원래 플라스크에 배지 10 ML을 추가합니다.
- 6 - 잘 접시, 각 우물에 중간 2 ML을 포함하는 새 접시의 해당 우물에 각 우물에서 세포 현탁액 2 ML을 전송. 원래 우물의 각 우물에 미디어 2 ML을 추가합니다.
- 추가 72 H. 모든 flasks과 접시를 품어 우리의 경험에서 대부분의 세포 라인은 이러한 통로 한 문화 (첨부된 stromal 세포를 통해 느슨하게 자기편 서스펜션 셀 집계의 존재가 설립 세포주의 초기 표시이다)에서 설정됩니다.
- 적게 또는 전혀 느슨하게 자기편 서스펜션 세포 집계와 문화, 신중하게 중간마다 72 H.의 약 50 %를 대체하여 flasks이나 접시를 피드 원래 문화의 세포를 제거 방지하기 위해, 문화 선박이 뜨는 매체의 부드러운 열망 전에 중력에 의해 아래에있는 세포의 퇴적물을하도록 서있는 최소한 5 분 그대로 남아 있습니다.
- 원래 flasks 및 접시 (첫 번째 구절 중에 약 3x106 / ML의 농도에서 세포 밀도를 유지의 성공적인 구축을 촉진 유지하면서 부화의 다섯 번째 하루의 끝에서, 세포는 1:1 비율로 passaged 아르 연속 세포주).
- 설립 세포 라인을 유지
- 설립 셀 라인은 새로운 flasks 및 플레이트로 passaged 있습니다. T - 25 T - 75 flasks 들어, 원본 또는 5 ML을 추가중간 5 ML에 통과 한 현탁액. 6 - 잘 접시 들어, T - 25 플라스크에 중간 7 ML에 원본 또는 통로 한 셀 서스펜션 3 ML를 추가합니다. 피드 신선한 배지로 제거 볼륨을 대체하여 원본 또는 통로 한 문화를 유지합니다.
- 통로는 새로운 T - 25 flasks로 셀 라인을 설립하였습니다. 셀 라인은 18-24 H.의 두 배로 시간을 문화가 일상적으로 1 3x106 / ML의 밀도 유지, 3 일마다 passaged 있습니다. 10 ML까지 할 수있는 새로운 매체 이전에 통과 문화의 필요한 볼륨을 추가합니다. 피드와 원래의 문화를 유지합니다.
- 몇 구절 후, 비 점착 성의 세포가 자기 점착 성의 stromal 세포없이 유지되며, 자기편 세포의 작은 숫자는 각 통로로 이월됩니다. 이 시점 이외에도, 문화가 T - 25 flasks을 처리하지 않는 조직 문화를 유지하실 수 있습니다.
5. 림프종 세포 라인을 동결 복구
- 셀 라인 20% FBS 및 10 % DMSO를 포함하는 신선한 RPMI 1640 배지에 냉동 수 있습니다.
- T - 25 플라스크 (약 1.5x10 6 셀 / ML)에 48 H 옛 문화의 세포는 상온에서 5 분 1,500 rpm으로 centrifuged 있습니다. 폐기 뜨는 후, 세포는 추위 동결 중간 2 ML에 다시 일시 중지됩니다. 각각의 플라스크에서 세포 현탁액의 두 1.0 ML 볼륨 즉시 -80시 냉동, 동결 튜브에 배치됩니다 ° C, 그리고 그 다음날 액체 질소로 전학 왔어.
- 전지는 빠른 해동하고, 신선한 문화 매체 10 ML에있는 내용을 resuspending하여 액체 질소 저장에서 복구됩니다. 또는, 갓 해동 세포는 신선한 문화 매체의 10 ML에 resuspending 전에 DMSO를 제거하는 따뜻한 문화 매체에 한 번 세탁하고 있습니다. 세포는 이후 통과하기 전에 최소한 72 H에 대한 양식입니다.
6. 대표 결과
ATM은 - / - T - 세포 라인이 프로토콜을 사용하여 개발된 및 지정 DWJ - ATM - 1 반 인 경우에는 3 번 CD - FITC, 안티 - CD4 - APC 및 안티 CD8 - PE 및 유동세포계측법 분석 (Figure1)와 얼룩에 의해 특징되었습니다. T - 세포의 90 % 이상 인 경우에는 3 번 CD, CD4 및 CD8 트리플 긍정했다.
그림 1.이 프로토콜을 사용하여 개발된 T - 세포 라인의 특성화.
/ - - 설립 ATM의 세포 표면 마커 세포 라인 DWJ - ATM - 1과 얼룩을 특징으로했다 지정한 안티 인 경우에는 3 번 CD - FITC, 안티 - CD4 - APC, 안티 - CD8 - PE 및 유동세포계측법 분석. 간단히, 1X10 6 신선한 세포는 차가운 PBS (1500 RPM / 5 분)에 한 번 씻어, 그리고 4 incubated 있었다 ° 1 % BSA와 PBS에서 1:200 희석에서 항체 칵테일 (각 항체의 μL 200 10 분 C. 신선한 이상 분석을 위해 고정. 수정된 세포가 4 % (권 / 권) 최종 농도에 추가 중립 버퍼 포르말린에 의해 준비 및 원심 분리에 의해 수확 30 분 (4 ° C에서 incubated하는 동안 세포는 즉시 검사 수있는 1,500 RPM / 5 분) 및 1 % BSA와 PBS 200 μL에 resuspended. 1 X 10 4 세포의 총 BD 외과 Calibur 분석기 및 CellQuest 소프트웨어 (BD Biosciences, 산호세, CA)를 사용하여 분석되었다.
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토론
이 프로토콜에서는, 우리는 두 개의 다른 마우스 genotypes에서 murine T - 세포 라인을 확립하기위한 자세한 절차를 제공한다 - / - [FVB/N- ATM tm1Led / J]와 p53의 - / - ATM [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . / - - 세 (5 시도 아웃) p53의 - / -이 프로토콜, 6 총 (7 시도 아웃) ATM을 사용하여 murine T - 세포 라인은 우리 연구실에서 설립되었습니다. / - - 그 세포주 DWJ - ATM - 1, ATM 보여주는 대표적인 데이터 셀 라인은 세포 표현 인 경우에는 3 번 CD, CD4 및 CD8 표면 마커보다 90 % 이상 그 clonal T - 세포 라인이 수...
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 도움이 토론을 위해 컬럼비아 대학에서 미생물학과 면역학의학과에서 박사 보리스 Reizis 감사하고 싶습니다. 우리는 또한 유동세포계측법 및 비디오 편집과 지원 루 후앙과 기술 지원에 대한 동물용 의약품의 대학, 코넬 대학에서 미생물학과 면역학의학과에서 박사 마가렛 바이노 박사 로드먼 겟첼 및 Deequa Mahamed 감사하고 싶습니다. / - - 생쥐 저자는 또한 p53의를 사육 및 genotyping에 대한 와이즈 실험실에서 자신의 중요한 원고와 비디오 제작의 검토, 그리고 스테파니 Yazinski에 대한 듀하멜 와이즈 실험실의 구성원을 감사하고 싶습니다. 동물 실험은 코넬 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 이 연구는 농업의 미국학과, 협동 상태 연구, 교육 및 연장 서비스, 동물 건강 및 질병 연구 프로그램 (검정 고시 및 RSW)을하고 NIH 보조금 R03 HD058220 및 R01CA108773 (RSW)을 제공한 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. 비디오 듀하멜 & 와이즈 연구소의 인력에 의해 자체 시설을 사용하여 제작되었습니다.
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재료
- 아이스 버켓
- 70 % 에탄올
- 알루미늄 호일과 핀이으로 덮여 거품 블록으로 구성된 해부 패드
- 작은 무균 가위와 집게 두 세트
- 무균 150mm 2 페트리 접시 (써모 피셔 과학, 월섬, MA;. 고양이 # 08-757-13)
- 멸균 18 게이지 바늘
- 50 ML 원뿔 튜브 (코닝 주식 회사, 코닝 NY, 고양이 # 430829)
- 10 % 포르말린 버퍼
- 조직 문화 flasks
- T - 25 (TPP, Trasadingen, 스위스, 고양이 # 90025)
- T - 75 (TPP, Trasadingen, 스위스, 고양이 # 90075)
- 6 - 잘 접시 (코닝 주식 회사, 코닝 NY, 고양이 # 3506)
- 멸균 인산은 생리 산도 7.2 (PBS)를 버퍼
- 문화 매체
- 25 MM HEPES, L - 글루타민은 (Lonza, 워커스빌, MD, 고양이 # 12 - 115F) 200 MM와 RPMI 1640 다음과 보충 :
- inactivated 10 % 열 (56 ° C, 30 분) 태아 소 혈청 (FBS; Hyclone, 로건, UT, 고양이 # SH30088.03)
- 1퍼센트 페니실린과 스트렙토 마이신 (Mediatech, 머내서스, VA, 고양이 # 30-002 - CI)
- 1퍼센트 불필요한 아미노산 (Mediatech, 고양이 # 25-025 - CI)
- 55 MM 2β - 메르 캅 토 에탄올 (시그마, 세인트 루이스, MO, 고양이 # M752)
- 25 MM HEPES, L - 글루타민은 (Lonza, 워커스빌, MD, 고양이 # 12 - 115F) 200 MM와 RPMI 1640 다음과 보충 :
- 디메틸 sulfoxide (DMSO, Calbiochem, 라 호야, CA, 고양이 # 317275)
- 항체 (eBioScience, 샌디에고, CA)
- 안티 인 경우에는 3 번 CD - FITC (cat. # 11-0031-85)
- 안티 - CD4 - APC (cat. # 17-0041-83)
- 안티 - CD8 - PE (cat. # 12-081-85)
- 보빈 알부민 혈청 (BSA, 생명 기술, 그랜드 아일랜드, NY,. 고양이 # 11018-017)
- Concanavalin A (시그마 고양이 # C5275)
- 1.8 ML 동결 튜브 (Nunc, 로스킬레, 덴마크, 고양이 # 368632)
참고문헌
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- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
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