여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 격리를 위해 방법을 설명합니다. 별 모양의 세포 정화 들어, 마우스 간은이 소화되게하여 현장에서과 체외에서 밀도 기울기 원심 분리하기 전에 pronase - collagenase 처리에 의해. 이 기술은 고도로 순수한 간장 별 모양의 세포를 산출.
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이 논문에서
요약
초록
간장 별 모양의 세포 스타 같은 형태의 간 세포 거주하고 간 사인 내피 세포와 hepatocytes 1,2 사이에 쭉 내려 가래의 공간에 위치하고 있습니다. 별 모양의 세포는 골수 엽 성의 전구 물질에서 파생 및 토탈 바디 비타민 A 1, 2의 80 %를 저장할 수 있습니다. 활성화되면, 별 모양의 세포 따라서 간 섬유증 3 기여, 세포외 기질을 생산 myofibroblasts로 구분. 계약을 자신의 능력에 따라 myofibroblastic 별 모양의 세포가 포털 고혈압 4 연관된 혈관 음색을 조절할 수 있습니다. 최근, 우리는 간장 별 모양의 세포가 강력한 항원 제시 세포이며, NKT 세포뿐만 아니라, 기존의 T lymphocytes 5 활성화할 수 있습니다 보여주었다.
여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 효율적인 준비 방법을 제시한다. 그들 perisinusoidal 현지화으로 인해, 간장 별 모양의 세포의 격리는 여러 단계로 이루어집니다. 쭉 내려 가래의 공간에서 고립에 액세스할 별 모양의 세포를 렌더링하기 위해서는 마우스 간은이 소화 효소 Pronase E와 Collagenase P. 다음과 재관류로 현장에 perfused 있으며, 간 조직은에 Pronase E와 Collagenase P와 함께 추가적인 효소 치료를 받게됩니다 체외. 이후, 방법은 간장 별 모양의 세포에 비타민 A - 저장 지질 방울의 엄청난 금액을 활용합니다. 이 기능은 8퍼센트 Nycodenz 기울기에 원심 분리하여 다른 간장 세포 유형에서 별 모양의 세포의 분리 수 있습니다. 프로토콜 여기에서 설명한은 별 모양의 세포의 매우 순수하고 동질적인 인구 산출. 준비 순도는 이전 형광 현미경이나 유동세포계측법에 의해 분석 마커 분자 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)에 대한 염색법에 의해 평가하실 수 있습니다. 또한, 가벼운 현미경은 지질 방울의 높은 금액을 가지고 있고, 별 모양의 간장 별 모양의 세포의 독특한 모양을 보여준다.
함께 찍은, 우리는 그들의 대표적인 형태학의 외관 이미지와 별 모양의 세포 실체를 정의하는 데 도움이 GFAP 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 효율적인 격리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
프로토콜
C57BL / 6 생쥐 ~ 20 세 주 이상에서 사용해야합니다. 25-30g 무게 남성 마우스의 사용을 권장합니다. 별 모양의 세포의 수율은 셀 절연을 별 모양 이전에 2 개월 쥐에게 비타민 A - 농축 다이어트 먹이를 증가 수 있습니다. Balb / C 마우스에서 별 모양의 세포의 수율이 상당히 높은 반면 약 2x10 5 간장 별 모양의 세포는 하나의 C57BL / 6 마우스의 간장에서 정화 수 있습니다. 다음 프로토콜은 5 마우스로 조정됩니다. 동물 관리 및 실험이 승인 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 마우스 간은 현장의 재관류에서 소화 효소와 함께
- 37 ° C의 물을 욕조에 SC1 버퍼와 효소 재관류 솔루션을 따뜻하게.
- 연동 펌프의 실리콘 튜브로 설정 날개 주입을 탑재합니다.
- 간의 재관류 현장에서 사용되는 유량입니다 6.5ml/min의 층류 흐름을 얻기 위해 PBS로 펌프를 보정합니다. SC1 솔루션과 실리콘 튜브를 평형.
- 케타민을 (90 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg) 솔루션과 깊이 마취제를 투여함을 보장하기 위해 반사 손실 테스트 intraperit....
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토론
간장 별 모양의 세포는 간장에 필수적인 생리와 pathophysiological 프로세스를 조절. 또한, 별 모양의 세포가 그들에게 간장 면역 반응의 중요한 구성 요소를 렌더링, 항원 제시 속성을 보유하고 있습니다. 간장 별 모양의 세포가 간 세포에있는 전체 번호 10~15%을 구성하지만, 이러한 세포의 격리는 쭉 내려 가래의 perisinusoidal 공간에서 자신의 로컬 라이제이션으로 인해 도전이다.
여기 현장 소화와 후속 구배 원심 분리에 의해 마우스 간은에서 간장 별 모양의 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 immunologic의 assays에 적합한 매우 순수 별 모양의 세포의 절연을 허용합니다.
고립된 세포의 실체는 별 같은 모양, perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles 및 GFAP의 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 세 가지 주요 특.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 바이오 메디컬 연구 및 NIH RO1 AI083426 - 01 (FW)에 우수 스미스 가족의 수상에 의해 투자되었다. 패트릭 Maschmeyer와 멜라니 Flach는 Boehringer Ingelheim 재단에서 박사 장학금 지원합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 70μm 셀 스트레이너 | BD | 352350 | |
| CaCL 2 X 2 시간 2 O | 시그마 - 알드리치 | C3306 | |
| Collagenase P | 로체 | 11249002001 | |
| DMEM | Gibco | 11,960 | |
| DNase I | 로체 | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031 - CV | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco | 16,000 | |
| 포도당 | 시그마 - 알드리치 | G7528 | |
| 기울기 원심 분리 튜브 | 그라 이너 바이오 원 | 163160 | |
| HEPES | Gibco | 15,630 | |
| KCL | 시그마 - 알드리치 | P9541 | |
| KH 2 PO 4 | 시그마 - 알드리치 | P9791 | |
| L - 글루타민 | Gibco | 25,030 | |
| MgCl 2 6H 2 O X | Fluka | 63,068 | |
| MgSO 4 7H 2 O X | 시그마 - 알드리치 | M2773 | |
| 나 2 HPO 4 X 2 시간 2 O | Fluka | 71,643 | |
| NaCl | 시그마 - 알드리치 | S3014 | |
| 아니 2 PO 4 X H 2 O | Fluka | 71,507 | |
| NaHCO 3 | Fluka | 71,628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | Gibco | 15,140 | |
| 연동 펌프 | 콜 파머 | HV - 7523-70 | |
| 페놀 레드 | 시그마 - 알드리치 | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| 실리콘 튜브 | Masterflex | HV - 96440-14 | |
| 나트륨 Pyruvate | Gibco | 11,360 | |
| 조직 문화 플라스크 (25cm 2) | BD | 353108 | |
| 빙게드 주입 세트 | Terumo | 1SV27EL |
참고문헌
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate ....
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