방법 논문

셀을 별 모양으로 일곱 단계

DOI:

10.3791/2710

⸱

2011년 5월 10일

 ,  , 
1Immune Disease Institute, Program in Cellular and Molecular Medicine at Children's Hospital, Department of Pathology, Harvard Medical School

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 격리를 위해 방법을 설명합니다. 별 모양의 세포 정화 들어, 마우스 간은이 소화되게하여 현장에서과 체외에서 밀도 기울기 원심 분리하기 전에 pronase - collagenase 처리에 의해. 이 기술은 고도로 순수한 간장 별 모양의 세포를 산출.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간장 별 모양의 세포 스타 같은 형태의 간 세포 거주하고 간 사인 내피 세포와 hepatocytes 1,2 사이에 쭉 내려 가래의 공간에 위치하고 있습니다. 별 모양의 세포는 골수 엽 성의 전구 물질에서 파생 및 토탈 바디 비타민 A 1, 2의 80 %를 저장할 수 있습니다. 활성화되면, 별 모양의 세포 따라서 간 섬유증 3 기여, 세포외 기질을 생산 myofibroblasts로 구분. 계약을 자신의 능력에 따라 myofibroblastic 별 모양의 세포가 포털 고혈압 4 연관된 혈관 음색을 조절할 수 있습니다. 최근, 우리는 간장 별 모양의 세포가 강력한 항원 제시 세포이며, NKT 세포뿐만 아니라, 기존의 T lymphocytes 5 활성화할 수 있습니다 보여주었다.

여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 효율적인 준비 방법을 제시한다. 그들 perisinusoidal 현지화으로 인해, 간장 별 모양의 세포의 격리는 여러 단계로 이루어집니다. 쭉 내려 가래의 공간에서 고립에 액세스할 별 모양의 세포를 렌더링하기 위해서는 마우스 간은이 소화 효소 Pronase E와 Collagenase P. 다음과 재관류로 현장에 perfused 있으며, 간 조직은에 Pronase E와 Collagenase P와 함께 추가적인 효소 치료를 받게됩니다 체외. 이후, 방법은 간장 별 모양의 세포에 비타민 A - 저장 지질 방울의 엄청난 금액을 활용합니다. 이 기능은 8퍼센트 Nycodenz 기울기에 원심 분리하여 다른 간장 세포 유형에서 별 모양의 세포의 분리 수 있습니다. 프로토콜 여기에서 설명한은 별 모양의 세포의 매우 순수하고 동질적인 인구 산출. 준비 순도는 이전 형광 현미경이나 유동세포계측법에 의해 분석 마커 분자 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)에 대한 염색법에 의해 평가하실 수 있습니다. 또한, 가벼운 현미경은 지질 방울의 높은 금액을 가지고 있고, 별 모양의 간장 별 모양의 세포의 독특한 모양을 보여준다.

함께 찍은, 우리는 그들의 대표적인 형태학의 외관 이미지와 별 모양의 세포 실체를 정의하는 데 도움이 GFAP 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 효율적인 격리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C57BL / 6 생쥐 ~ 20 세 주 이상에서 사용해야합니다. 25-30g 무게 남성 마우스의 사용을 권장합니다. 별 모양의 세포의 수율은 셀 절연을 별 모양 이전에 2 개월 쥐에게 비타민 A - 농축 다이어트 먹이를 증가 수 있습니다. Balb / C 마우스에서 별 모양의 세포의 수율이 상당히 높은 반면 약 2x10 5 간장 별 모양의 세포는 하나의 C57BL / 6 마우스의 간장에서 정화 수 있습니다. 다음 프로토콜은 5 마우스로 조정됩니다. 동물 관리 및 실험이 승인 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 마우스 간은 현장의 재관류에서 소화 효소와 함께

  1. 37 ° C의 물을 욕조에 SC1 버퍼와 효소 재관류 솔루션을 따뜻하게.
  2. 연동 펌프의 실리콘 튜브로 설정 날개 주입을 탑재합니다.
  3. 간의 재관류 현장에서 사용되는 유량입니다 6.5ml/min의 층류 흐름을 얻기 위해 PBS로 펌프를 보정합니다. SC1 솔루션과 실리콘 튜브를 평형.
  4. 케타민을 (90 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg) 솔루션과 깊이 마취제를 투여함을 보장하기 위해 반사 손실 테스트 intraperitoneal 주사로 마우스를 마취.
  5. 적당한 기지에 위로 향한 위치에 마우스를 수정.
  6. 복부 피부에 세로 절개를 수행하고 복막을 폭로하기 위해 가위와 집게를 사용하십시오.
  7. 조심스럽게 복막을 열고 포털 정맥을 노출하기 위해 동물의 왼쪽으로 복강의 내장을 이동합니다.
  8. 포털 정맥에 주입 세트의 정맥을 넣습니다. 이 단계에 대한, stereomicroscope의 사용을 권장합니다.
  9. 30ml SC1 솔루션으로 간의 재관류를 시작합니다. 즉시 흐름을 시작 후 베나 카바 하부를 엽니다. 간장의 성공 플러싱은 간 조직의 색깔의 손실로 표시됩니다.
  10. 30ml Pronase 전자 솔루션으로 간을 Perfuse. 성공적으로 소화시 간 엽 (叶)이 팽창되며, lobules은 캡슐을 통해 뚜렷한 나타납니다.
  11. 30ml Collagenase의 P 솔루션으로 간을 Perfuse. 이 시점에서 간은 그 모양을 잃고 이완증의 및 비정질 보인다 있습니다.
  12. 신중하게 횡경막과 주변 장기에서 간장을 분리하고 그것은 얼음 70ml SC2 용액에 보관합니다.
  13. 추가 생쥐에 대한 절차를 반복합니다.

2. 마우스 간은의 체외의 소화에

모든 추가 작업 단계 층류 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.

  1. 날카로운 가위를 사용하여 약 2x2x2mm 3 조각으로 간을 잘라.
  2. Pronase E - Collagenase P 솔루션 50ml로 간 조각을 포함 70ml SC2의 정지를 결합하고 DNase I 솔루션의 1ml를 추가합니다.
  3. 37 20 분 대한 간은을 소화 ° C가 감동하는 동안.

3. 밀도 기울기 원심 분리 장치

  1. 6 50ml 팰컨 튜브로 70μm 셀 strainers 통해 세포 현탁액을 필터링하고 SC2 버퍼 50ml까지 추가할 수 있습니다. 600g 4 ° C.에 10 분에 대한 원심 분리기
  2. 조심스럽게 뜨는의 40ml를 대기음, 다음 각 튜브에 150μl DNase I 솔루션을 추가하고 세포를 resuspend.
  3. 4 50ml 팰컨 튜브에 수영장 셀 suspensions과 600g 4시 10 분에 대한 GBSS - B, 원심 분리기로 씻어 ° C.
  4. 조심스럽게 펠렛 각 튜브에 추가 150μl DNase I 솔루션을 방해하지 않고 최대한 뜨는의를 대기음. 튜브 당 10ml GBSS - B의 세포 알약을 Resuspend.
  5. 수영장 2 50ml 팰컨 튜브에 세포 튜브 당 36ml의 총 볼륨 GBSS - B를 추가합니다. 각각의 튜브에 14ml Nycodenz 솔루션을 추가하고 잘 섞는다.
  6. 총 10 튜브의 결과로 하나 12ml 기울기 원심 분리 튜브에 세포 현탁액의 10ml를 전송합니다. 부드럽게 1.5ml GBSS - B 당 튜브와 세포 현탁액을 오버레이.
  7. 1,500그램 4에서 15을 위해 그라디언트를 원심 ° C 브레이크없이. 별 모양의 세포가 흰색 고리로서 계면에서 발견되는 반면, 그 후, hepatocytes는 튜브의 하단에 pelleted 것입니다.
  8. 조심스럽게 별 모양의 세포를 포함하는 계면을 수확하고 GBSS - B와 함께 그들을 씻고, 600g, 4에서 원심 분리기를위한 10 분 ° C.
  9. 뜨는을 대기음와 10 %의 열 inactivated FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2mM L - 글루타민, 1mM 나트륨 pyruvate 및 10mM HEPES와 보충 20ml DMEM에있는 세포를 resuspend. 2x10 4 셀 / cm 2 농도와 조직 문화 flasks에 세포를 전송합니다. 37 ° C와 5% CO 2에있는 세포를 품어.
  10. 즉시 간장 별 모양의 세포가 죽은 세포와 세포 부스러기를 씻어 (약 2 시간 준비 후) 자기편 그대로 미디어를 변경합니다.
  11. 다음 날, 별 모양의 세포에S는 perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles과의 특성 별 모양의 형태를 개발해야합니다.
  12. 후속 실험, 간장 별 모양의 세포는 쉽게 같은 Accutase, 예를 들어 같은 가벼운 효소 솔루션을 사용하지 않는 코팅 플라스틱 표면에서 분리 수 있습니다

4. 대표 결과 :

제공된 프로토콜을 사용하여 간장 별 모양의 세포의 준비 다음, 고립된 인구의 순도는 이러한 glial fibrillary 산성 단백질의 스타와 같은 모양, perinuclear 지질 방울, 그리고 표현 (GFAP로 세포 유형의 세 가지 주요 특성을 고려하여 테스트를 수 ). 특성 세포 분리 후 간장 별 모양의 세포의 2 시간의 외관뿐만 아니라 체외 문화의 날 1 3에 대한 대표적인 사진은 그림 1에 묘사된 있습니다. 그림 2는 세포 격리 다음 3 일간 교양되었습니다 간장 별 모양의 세포에서 GFAP에 대한 대표 immunofluorescence 염색법을 보여줍니다. 간장 별 모양의 세포는 체외 문화 중에 myofibroblastic 세포로 구별. 이러한 활성 별 모양의 세포의 특성 특징은 알파 평활근 굴지 (αSMA)의 표현이다. 그림 3은 체외 문화의 날 7 활성화 별 모양의 세포에 aSMA과 마이 오신 IIA에 대한 immunofluorescence 염색법을 보여줍니다.

figure-protocol-1
그림 1. 간성 별 모양의 세포의 특성 형태. 별 모양의 세포가 제공하는 프로토콜을 사용하여 마우스 간은으로부터 격리되었다. 이미지가 별 모양의 세포가 세포 격리 후 2 시간 (A, B)뿐만 아니라 1 일 (C)와 체외 문화의 3 일 (D)에 대한 묘사. 간장 별 모양의 세포가 perinuclear 사이트에서 지질 vesicles 높은 금액을 전시하고 체외 문화의 첫 번째 일 (확대 200x) 동안 자신의 특유의 아스트랄과 같은 형태를 취득.

figure-protocol-2
그림 2. 간성 별 모양의 세포는 특히 간장에 GFAP을 표현. 별 모양의 세포는 체외 문화의 날 3 격리 및 immunofluorescently GFAP (적색)에 얼룩했다. 세포 핵은 파란색 (Hoechst는 얼룩)에 그려져있다.

figure-protocol-3
그림 3. 간 별 모양의 세포가 myofibroblasts로 구분. C57BL / 6 마​​우스에서 분리된 간장 별 모양의 세포는 7 일 교양되었습니다. 그 후, 그들은 챔버 슬라이드로 전송하고 aSMA (빨간색으로 표시)과 마이 오신 IIA (녹색에 묘사된)에 얼룩했다. 세포 핵은 Hoechst (파란색)과 counterstained되었습니다.

SC1 버퍼
EGTA 190mg
포도당 900mg
HEPES 1M 재고 솔루션 10 ML
KCl 400mg
나 2 HPO 4 X 2 H 2 O 151mg
NaCl 8g
아니 2 PO 4 X H 2 O 78mg
NaHCO 3 350mg
페놀 레드 6mg
DH 2 O 1리터까지 작성
SC2 버퍼
CaCl 2 X 2 시간 2 O 560mg
HEPES 1M 재고 솔루션 10ml
KCl 400mg
나 2 HPO 4 X 2 H 2 O 151mg
NaCl 8g
아니 2 PO 4 X H 2 O 78mg
NaHCO 3 350mg
페놀 레드 6mg
DH 2 O 1리터까지 작성
GBSS - 버퍼
KCl 370mg
CaCl 2 X 2 시간 2 O 225mg
포도당 991mg
KH 2 PO 4 30mg
MgCl 2 X 6 H 2 O 210mg
MgSO 4 X 7 H 2 O 70mg
나 2 HPO 4 X 2 H 2 O 75mg
NaHCO 3 227mg
페놀 레드 6mg
DH 2 O 1리터까지 작성
GBSS - B 버퍼
CaCl 2 X 2 시간 2 O 225mg
포도당 991mg
KCl 370mg
KH 2 PO 4 30mg
MgCl 2 X 6 H 2 O 210mg
MgSO 4 X 7 H 2 O 70mg
나 2 HPO 4 X 2 H 2 O 75mg
NaCl 8g
NaHCO 3 227mg
페놀 레드 6mg
DH 2 O 1리터까지 작성
Pronase 전자 재관류 솔루션
Pronase E 100mg (4000 PU / MG 분)
SC2 버퍼 200ml
Collagenase P 재관류 솔루션
Collagenase P 85mg (1.78 U / MG lyo)
SC2 버퍼 200ml
Pronase E - Collagenase P 솔루션
Pronase E 50mg (4000 PU / MG 분)
Collagenase P 85mg (1.78 U / MG lyo)
SC2 버퍼 50ml
DNase I 솔루션
DNase I 6mg (ca. 2000U/mg)
GBSS - B 3ml
Nycodenz 솔루션
Nycodenz 8g
GBSS - A 28ml

표 1. 버퍼와 간장 별 모양의 세포의 분리에 필요한 효소 솔루션을 제공합니다. 모든 버퍼의 산도는 7.3-7.4로 조정해야합니다. 또한, 모든 버퍼의 무균 여과 권장합니다. 해당 효소 활동에 따라 사용되는 효소의 양을 적응하는 것이 중요합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

간장 별 모양의 세포는 간장에 필수적인 생리와 pathophysiological 프로세스를 조절. 또한, 별 모양의 세포가 그들에게 간장 면역 반응의 중요한 구성 요소를 렌더링, 항원 제시 속성을 보유하고 있습니다. 간장 별 모양의 세포가 간 세포에있는 전체 번호 10~15%을 구성하지만, 이러한 세포의 격리는 쭉 내려 가래의 perisinusoidal 공간에서 자신의 로컬 라이제이션으로 인해 도전이다.

여기 현장 소화와 후속 구배 원심 분리에 의해 마우스 간은에서 간장 별 모양의 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 immunologic의 assays에 적합한 매우 순수 별 모양의 세포의 절연을 허용합니다.

고립된 세포의 실체는 별 같은 모양, perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles 및 GFAP의 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 세 가지 주요 특...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 바이오 메디컬 연구 및 NIH RO1 AI083426 - 01 (FW)에 우수 스미스 가족의 수상에 의해 투자되었다. 패트릭 Maschmeyer와 멜라니 Flach는 Boehringer Ingelheim 재단에서 박사 장학금 지원합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
70μm 셀 스트레이너 BD 352350
CaCL 2 X 2 시간 2 O 시그마 - 알드리치 C3306
Collagenase P 로체 11249002001
DMEM Gibco 11,960
DNase I 로체 10104159001
DPBS Cellgro 21-031 - CV
EGTA Fluka 3777
태아 소 혈청 Gibco 16,000
포도당 시그마 - 알드리치 G7528
기울기 원심 분리 튜브 그라 이너 바이오 원 163160
HEPES Gibco 15,630
KCL 시그마 - 알드리치 P9541
KH 2 PO 4 시그마 - 알드리치 P9791
L - 글루타민 Gibco 25,030
MgCl 2 6H 2 O X Fluka 63,068
MgSO 4 7H 2 O X 시그마 - 알드리치 M2773
나 2 HPO 4 X 2 시간 2 O Fluka 71,643
NaCl 시그마 - 알드리치 S3014
아니 2 PO 4 X H 2 O Fluka 71,507
NaHCO 3 Fluka 71,628
Nycodenz Accudenz AG AN7050/BLK
페니실린 / 스트렙토 마이신 Gibco 15,140
연동 펌프 콜 파머 HV - 7523-70
페놀 레드 시그마 - 알드리치 P4633
Pronase E Calbiochem 7433-2
실리콘 튜브 Masterflex HV - 96440-14
나트륨 Pyruvate Gibco 11,360
조직 문화 플라스크 (25cm 2) BD 353108
빙게드 주입 세트 Terumo 1SV27EL

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
  2. Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
  3. Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
  4. Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
  5. Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
  6. Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
  7. Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

NycodenzPronase ECollagenase PGFAP

관련 논문