셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 - 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 - 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제.
효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된
Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT - 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT - 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다.
400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT - 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT - 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜
1. 세포의 준비
- 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT - 1 NIT - 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 - 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 당 5x10 4 8 - 잘 랩 - 탁 II chambered coverglass의 씨앗 세포, 그리고 세포 독성 실험에 사용하기 전에 48 시간 성장할 수 있습니다.
- 제어 T 세포 라인 문화 : 부정적인 제어로 (ATCC, 인 경우에는 3 번 CD + 인간 림프구 세포주) Jurkat 세포주를 사용하십시오. RPMI1640의 문화 Jurkat 세포 10 % FBS와 보충 2 MM L - 글루타민, 1.5 g / L 나트륨 중탄산염, 10 MM의 HEPES 및 1.0 MM 나트륨 pyruvate.
2. 효과기 CD8 +
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토론
세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 - 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 - 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변화에 집중했다. Mitochondrial 막 잠재적인 소실은 apoptosis 8 이어지는 mitochondrial 기능 변경하는 동안 일찍 되돌릴 단계입니다. 공촛점 현미경 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 autoreactive T lymphocytes와 상호 작용하는 동안 베타 세포 mitochondrial 막 잠재적인 소실을 시각화 수 있었다. 이 실험 설정은 T1D의 개발 기간 동안 베타 .......
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공개 사항
동물 실험은 플로리다 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.
감사의 글
이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| CR - 51 | 퍼어킨 엘머 | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine 메틸 에스테르 (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | 아미노산 서열 : YFIENYLEL | |
| IL - 2 | R & D | 485 - MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11,885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060 - CL | |
| 멤 비 필수 아미노산 | GIBCO | 11,140 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | 쌍둥이 자리 | 400-109 | |
| 페놀 레드없는 DMEM | 시그마 | D5303 | |
| CO2 인큐베이터 | 써모 피셔 | HeraCell 150i | 세포 배양을위한 무균 보관 |
| 생물 안전 캐비닛 | 써모 피셔 | 견적 1440 | |
| 일회용 문화 튜브, 6x50 mm 라임 유리 | 어부 | 14-958 - | |
| 감마 카운터 | 퍼어킨 엘머 | 마법사 1470 자동 감마 카운터 | |
| 공촛점 현미경 | 자이스 혈구 | LSM 510 메타 공촛점 | 전동 무대와 라이브 셀 챔버와 함께 |
| 피펫 (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| 튜브 (앰버) | 어부 | 50819772 | |
| 원심 분리기 | Sorvall 레전드 RT + | 75004377 | |
| Hemacytometer | 피셔 사이 언티픽 | 267110 | |
| 입식 현미경 | 자이스 혈구 | Axioskop40 | |
| NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 | 잭슨 연구소 | 004347 | |
| NOD.Cg - Rag1 tm1Mom TG (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ 쥐 | 잭슨 연구소 | 004348 | |
| NOD - AI4α / β F1 마우스 | N / A | N / A | UF 동물 시설에서 자란 |
참고문헌
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
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