우리는 수용체에 과립 세포 대식 세포 콜로니 - 자극 인자의 바인딩 (GM - CSF)를 추정하기 위해 셀 무료 수용체 결합 분석을 설계했습니다. 그것은 우수한 재현성과 GM - CSF autoantibody에 의해 용해 GM - CSF 수용체 알파에 바인딩 GM - CSF biotinylated의 경쟁 억제를 평가하는 데 있습니다.
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방법 논문
재조합 가용성식이 GM - CSF 수용체를 사용하여 GM - CSF 항체의 중화 능력을 예측 세포 분석 시스템 무료
이 논문에서
요약
초록
배경 : 이전, 우리가 중화 능력을 보여주지만, GM - CSF autoantibody 아니다 농도가 면역 폐의 폐포의 proteinosis (PAP) 1-3 환자의 질병 심각와 상관했다. 폐에 GM - CSF의 bioactivity 폐기가 4,5 면역 PAP에 대한 가능성이 원인이기 때문에, 그것은 PAP 각 환자의 질병 심각도를 평가하기위한 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력을 측정하는 약속입니다.
지금까지 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력은 인간의 골수 세포 또는 GM - CSF 6-8로 자극 TF - 1 세포의 성장 억제를 평가하여 평가되었습니다. bioassay 시스템에서, 그러나, 그것은 지속적인 상태로 세포를 유지 기술적인 문제로 인해 서로 다른 실험실에서 데이터를 비교하기 위해 신뢰할 수있는 데이터뿐만 아니라를 얻기 위해 종종 문제가됩니다.
목표 : 세포없는 수용체 결합 - 검정을 사용하여 세포 표면에 GM - CSF 수용체에 바인딩 GM - CSF를 모방합니다.
방법 : 트렌스 제닉 누에 기술은 고순도 9-13로 재조합 수용성 GM - CSF 수용체 알파 (sGMRα)에 대한 큰 금액을 얻기 위해 적용되었다. 재조합 sGMRα은 실크 단백질에 융합되지 않고 실크 스레드의 친수성 sericin 층에 포함된되었고, 따라서, 우리는 쉽게 중립 수성 솔루션 14,15 잘 순도의 고치에서 추출할 수 있습니다. 다행히도, GM - CSF와 바인딩에 대한 중요한 올리 고당 구조는 다른 곤충이나 효모에 의해 만들어진보다 인간 sGMRα의 구조에 더 비슷합니다.
결과 : sGMRα를 사용하여 셀 - 무료 분석 시스템이 높은 소성과 안정성으로 데이터를 굴복. sGMRα에 바인딩 GM - CSF는 sGMRα를 사용하여 새로운 세포가없는 분석 시스템이 중화 활동의 측정에 대한 더 유용하다는, TF - 1 세포를 사용하여 bioassay와 비슷한 방식으로 polyclonal GM - CSF autoantibody에 의해 저해 약을 - dependently되었습니다 TF - 1 세포 또는 인간의 골수 세포를 사용하여 bioassay 시스템보다 GM - CSF의 autoantibodies니다.
결론 : 우리는 GM - CSF autoantibody의 중화 능력을 quantifying 셀 - 무료 분석을 설립했습니다.
프로토콜
1. sGMRα의 생산 및 정화
- 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)에 의해 인간의 태반 cDNA 라이브러리에서 sGMRα의 cDNA 확대.
- 그의 태그 다른 PCR에 의해 PCR의 amplicon에 3 '끝에 50 기본 baculovirus의 polyhedrin 엔드의 5' - UTR 순서 27 기본 코딩 RGS를 추가합니다.
- 플라스미드 pMSG1.1MG로 증폭 PCR 제품을 넣습니다.
- 도우미 벡터 누에 쿨러 - W1 스트레인의 계란에 pHA3PIG로 구성 psGMR/M1.1MG을 주사.
- 25 나방에 후면 부화 유충 G0 ° C. 형질 누에가 sGMRα 유전자를 베어링 얻기 위해 눈에 MGFP 표현을 위해 형제간에 또는 쿨러 - W1과 짝짓기로 확인한 화면 G1의 배아.
- 500mM NaCl을 포함하는 인산염 버퍼와 유전자 변형 누에의 고치에서 재조합 sGMRα을 추출하고 4 저어 ° C를 24 시간을위한.
- 이 precipitates 제거하는 15에 대한 20,000그램에서 샘플을 원심 분리기.
- 니켈 - 친화 컬럼에 뜨는 적용됩니다.
- 10mM 이미다졸, 500mM NaCl 및 20mM 인산 나트륨, pH6.3, 그리고 10mM에서 25....
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토론
셀 - 무료 분석 뛰어난 재현성과 인텔리와 GM - CSF의 autoantibodies의 중화 능력을 추정했다. GM - CSF의 autoantibodies 또는 환자의 혈청 IgG의 분수에 의해 바인딩을 억제이 분석에 의해 평가되었다. 데이터 셀없는 분석의 바인딩 억제 각각 TF - 1 세포를 사용하여 bioassay의 성장을 억제 사이의 상관을 보여주었다. bioassay 널리 이용하지만, 여러 가지 시설과 우리는이 새로운 시스템을 사용하여 피할 수 있습니다 다른 시간 지점 사이의 데이터를 비교에 어려움을 숨겨왔다.
GM - CSF는 낮은 선호도와 sGMRα에 바인딩하고 바이너리 복잡한 형태 20. 최근 연구는 인간의 GM - CSF는 GM - CSF 수용체 알파와 세포 표면 21 높은 친화력을 가진 dodecameric 복잡한를 형성 GM - CSF 수용체 베타에 바인딩되는 보여주었다. 따라서, GM - CSF monomeric 수.......
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공개 사항
우리는 공개 없어요.
감사의 글
우리가 그들의 귀중한 공헌에 대한 K. Nakagaki 박사 H. 이시이 박사 K. 스즈키, A. 야마가타, K. Oofusa 매우 감사하고 있습니다.
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참고문헌
- Arai, T. Serum neutralizing capacity of GM-CSF reflects disease severity in a patient with pulmonary alveolar proteinosis successfully treated with inhaled GM-CSF. Respir Med. 98, 1227-1230 (2004).
- Tazawa, R.
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재인쇄 및 허가
