우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
돌기 세포 (DCS)은 자사의 개시 및 감염 1 반응에서 중요한 역할을 면역 시스템의 센티넬 간주될 수 있습니다. 나이브 DC가에 의해 병원성 항원의 검색은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)로 불리는 특정 보존 구조를 인식할 수있는 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 통해이다. DC가로 PAMPs가 탐지 성숙 DC가 자신의 활성화 및 변화의 결과로 세포내 신호 폭포를 트리거합니다. 이 과정은 일반적으로 다른 전염증성 크린 시토킨와 함께 제 1 형 인터페론의 생산이 특징입니다, 이러한 T 세포와 상호 작용이 적응 면역 반응 2을 시작 배수 림프절에 성숙한 DC의 MHCII와 CD86 및 마이 그 레이션과 같은 세포 표면 마커의 upregulation, 3. 따라서 DC가 그 본래 및 적응 면역 시스템을 연결합니다.
각종 병원균에 DC 응답을 기본 분자 네트워크를 해부하다하는 능력은 이러한 신호 경로의 규제 및 유도 유전자를보다 잘 이해하는 데있어 매우 중요합니다. 또한 전염병 및 종양에 대한 DC - 기반 백신의 개발을 용이하게 도움이 될 것입니다. 그러나, 연구의이 라인은 심각하게 기본 DC가 4 transfecting의 어려움으로 장애가되었습니다.
같은 lentiviral 시스템으로 바이러스 전달 방식은, 일반적으로 사용하지만, 이러한 복잡 성과 바이오 유해 위험 (관련 비용) 5,6,7,8 많은 한계를 가지고있다. 또한, 바이러스성 유전자 제품의 배달 DC가 9,10,11,12을 transduced 사람의 immunogenicity을 증가시킵니다. Electroporation은 혼합 결과 13,14,15와 함께 사용하지만, 우리는 높은 처리량 transfection 프로토콜의 사용을보고하고 결론의 유틸리티를 입증하는 최초되었습니다.
이 보고서에서 우리는 제한된 세포 독성 및 DC 성숙 16 부재와 함께, 인간의 기본 DC가의 높은 처리량 transfection을 위해 최적화된 상용 프로토콜을 요약합니다. Transfection 효율 (GFP 플라스미드의)와 세포 생존 능력은 각각 50 % 이상 70 % 였어요. qRT - PCR은 IFNβ 전혀 upregulation을 증명하지 동안 외과 분석, transfected 세포의 성숙 마커 CD86와 MHCII 표현 증가의 부재를 설립하였습니다. 이 electroporation 프로토콜을 사용하여, 우리는 siRNA와 효과적인 타겟 유전자의 허물고와 DC가 성공적으로 transfection에 대한 증거를 제공하는 장비 - I, mRNA와 단백질 수준 모두에서 핵심적인 바이러스성 인식 수용체 16,17.
프로토콜
1. 프로그램 Amaxa 96 잘 셔틀 Nucleofector
- 새 매개 변수 파일을 엽니다.
- 당신이 96 잘 플레이트 그림 위에 커서를 드래그하여 표준 transfection에 사용됩니다 웰스의 번호를 선택합니다. 각 실험 샘플에 대해 수영장 3 웰스의 최소 사용합니다.
- 입력 프로그램 코드 : part1 선택 'FF'와 파트에서 선택한 '168 '메뉴를 풀다운에서
- 솔루션 박스 선택 '단핵구, 인간'에서
- 제어 옵션에서 '표준'을 선택합니다.
- 적용을 클릭합니다.
- 노 transfection 컨트롤을 포함하려면 필요하고 제어 옵션에서 '없음 프로그램 제어'를 선택하지하고 적용을 클릭하면 다이어그램에서 더 이상 우물을 선택합니다.
- 플레이트 다이어그램에 남아있는 사용하지 않는 우물을 선택하고 Undefine을 클릭합니다.
2. transfection에 대한 DC가 준비
- 모든 작업은 가능한 세포 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 추가하여 nucleofection 솔루션을 준비 96 - 잘 450-2025의 비율에 인간 단핵구 96 잘 Nucleofector 솔루션....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
나이브 기본 돌기 세포의 transfection 효율이 높은 처리량 분석 및 본래 - 적응 면역 전환을 중재이 핵심 세포 세포 염증 경로의 리버스 엔지니어링을 위해 중요합니다. 그러나, 대부분의 조사는 이러한 세포가 표준 transfection 기술을 사용하는 경우 모두 효율적으로 transfection 절차 유도 세포 성숙하지 않고 transfect하기 어려운다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 이러한 제한이 동시에 독립 96 - 웰 상업용 핵 transfection 시스템 (Lonza)를 사용하여 높은 처리량 프로토콜 최적화에 의해 극복할 수 있는지 여부를 조사 하였다.
형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여, 우리는 GFP - 표현 세포 성숙의 판독으로 transfection 효율과 CD86 및 MHCII immunoreactivity위한 표식으로 플라스미드를 측정했습니다. 궁극적으로> 50 %의 transfection과 성숙 마커 증가의 부재를 보여주는 조건을 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 프로젝트는 NIH NIAID 계약 번호 HHSN2662000500021C에 의해 지원되었다. 우리는 그의 기술 지원 밍 첸 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 장비 / 시약 | 회사 | 카탈로그 # | 댓글 |
| Amaxa Nucleofector 96 - 웰 셔틀 | Lonza | 108S0109 | 일련 번호 |
| Amaxa 인간 단핵구 96 - 웰 Nucleofector 키트 | Lonza | VHPA - 2007 | 인간 단핵구 96 - 웰 Nucleofector 솔루션, 96 잘 보충하고 Nucleocuvettes과 접시를 포함 |
| 장비 - I siRNA | Dharmacon | L - 012511-00 | |
| 글로의 siRNA | Dharmacon | D - 001600 - 01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11,875 | 10% FCS와 보충이 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린 및 DC 성장 매체를 100 μg / ML 스트렙토 마이신 |
| DMEM | Invitrogen | 11,965 | |
| L - 글루타민 | Invitrogen | 25030081 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | Invitrogen | 15070063 | |
| 소태아 혈청 | HyClone | 3070.03 | |
| 돌기 세포 | 뉴욕 블러드 센터 | DC가이 표준 절차를 사용하여 버피의 외투에서 정화 아르 |
참고문헌
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
