산화 세포 환경을 감지하는 심사 방법은 CM - H2DCFDA의 산화를 측정하는 것입니다. 일단 비 형광의 형광 화합물로 세포, CM - H2DCFDA 변경 내에 산화. 형광에이 변경 사항은 유동세포계측법으로 측정하고 산화 환경에서 세포의 수를 나타냅니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
의 연결을 손상을 유도 바이러스의 자주 제안 메커니즘은 산화 스트레스입니다. Astrocytes는 중추 신경계 (CNS)의 산화 스트레스를 조절에 중요한 역할을했습니다. Astrocytes는 반응 산소 종 (ROS)에서 뉴런뿐만 아니라 보호하는 뉴런에 생체 항상성 환경을 유지할 수 있도록 도와주십시오. CM - H2DCFDA는 ROS의 존재에 대한 세포 침투성 표시기입니다. CM - H 2 DCFDA이 아닌 형광 화합물로 세포를 입력하고, 휴대폰 esterases은 아세테이트 그룹을 제거한 후 형광되고, 화합물이 산화됩니다. 녹색 fluorescing 것으로 판단될 유동세포계측법에 의해 측정한 세포의 숫자는 산화 상태에있는 세포의 수를 나타냅니다. CM - H 2 DCFDA 다른 ROS 다수에 의해 산화 쉽습니다. 이 분석에 관계없이하는 산소의 산화 세포 환경을 화면으로 사용할 수로 ROS는 CM - H 2 DCFDA을 산화 수있는에 대한 특이성의이 부족은,이 화합물 pathogenesis 조사의 초기 단계에 사용하기 위해 가치있는 리젠트합니다 ROS의 급진 또는 조합은 세포 조건에 책임이 있습니다. 일단 그것은 ROS가 CM - H 2 DCFDA의 산화에 의해 현재 다음 추가 실험이 ROS 또는 로스의 조합이 특정 pathogenesis 과정에 참여하는 결정하기 위해 수행할 수있는 것으로 설립되었습니다. 본 연구의 결과는 과산화수소 CM - H 2 DCFDA의 증가 또한이 분석은 G355 - 5 세포 내에서 산화 환경을 검출을위한 가치있는 테스트입니다 나타내는 생리 컨트롤에 상대적으로 감지되었습니다 형광 것을 입증 고양이 astrocyte 세포 라인.
프로토콜
1. 세포 고양이 astrocytes의 문화와 H 2 O 2와 치료
- 37 DMEM 미디어 플러스 영양소와 75cm이 플라스크에 문화 세포주 G355 - 5 ° C와 5% CO 2 60 % 합류 (~ 5 일)까지. 모든 1~2일 미디어를 교체 또는 건강한 문화를 유지하는 데 필요한.
- 미디어를 제거하고 0.25 %의 트립신 2 ML를 추가합니다. 45 S에 대한 pipetting하여 세포를 리프트 - 실내 온도 (RT)에서 1 분.
- 신속 미디어 10 ML을 포함한 15 ML 원뿔 관에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 부드럽게 섞는다.
- 펠렛을 얻기 위해 3 분 300 XG, 23 ° C에서 원심 분리기. 펠렛을 방해하지 않고 뜨는 폐기하십시오.
- 신선한 미디어 6-7 ML을 추가하고 세포를 resuspend.
- 6 잘 플레이트의 각 잘하는 셀 ~ 1 ML을 추가합니다. 각 물론 미디어로부터 2-3 ML을 추가하고 80~90%의 합류까지 품어.
- 미디어 과산화수소의 100μM 솔루션 (H 2 O 2)를 준비합니다.
- 각 우물에서 미디어를 제거하고 하나 둘 ML 신선한 매체 (제어), H 2 O 2 (치료) 또는 DPBS의 2ml 2 ML로 바꿉니다. ° C, 5 % CO 2 3 H. 위해 37 알을 품다
- 솔루션을 제거하고 세포를 리프트하는 트립신 1 ML를 추가합니다. 0.5 ML의 DPBS을 포함하는 1.7 ML Eppendorf 튜브에 세포를 전송합니다. 이 단계는 연장 트립신 보육에서 세포 죽음을 방지하기 위해 각 잘 개별적에서 수행되어야합니다.
- 3 분 300 XG에 스핀, 버리고 뜨는 및 DPBS 1 ML에 resuspend.
2. ROS를위한 염색법
- 얼룩의 모든 단계 표백 방지하기 위해 최소한의 빛의 노출을 실시해야합니다.
- 긍정적인 제어 50 MM의 CCCP 1 μl를 추가합니다. 37 품어 ° C, 5 % 5 분 CO 2.
- H 2 O 2 그룹 10 MM CM - H 2 DCFDA 솔루션 5 μl를 추가합니다. 37 품어 ° C 5 % CO 15-30 분 2. 아무 얼룩은 생리 예제에 추가하지 않습니다.
- 잔여 얼룩을 제거하는 DPBS 2 ML과 샘플을 씻으십시오.
- 펠렛을 얻기 위해 3 분 300 XG에 스핀.
- DPBS 0.5 ML에서 세포를 Resuspend. 생리를 제외하고, 각 예제 1 μl PI를 추가합니다.
- 5ml 흐름 cytometer 튜브에 샘플을 전송합니다.
- 흐름 cytometer를 실행합니다.
3. 유동세포계측법
- 525, 775 및 620 nm의 모든 ± 20 nm의 : 488 nm의 아르곤 레이저 다음과 같은 밴드 패스 갖춘 베크맨 쿨터 FC500 (또는 이에 상응하는 금액)에서 샘플을 실행합니다.
- 해당 컨트롤을 준비 : 흠없는 세포가, CM - H 2 DCFDA은 (대조군) PI 단, 더블 스테인드 밖에 스테인드.
- FS 대 SS, PI 대 CM - H 2 DCFDA 다음 histoplots을 가진 프로토콜을 확인합니다. 또한 다음과 같은 histograms을 가집니다 얼룩에 해당하는 휴대폰 번호 대 FL1, FL2 및 FL3을.
- 샘플을 실행하기 전에, 장비, 유체 및 폐기물 컨테이너를 확인합니다. 최소한 20 분 장비를 따뜻하게.
- 장비를 청소하고 제조 업체의 표준에 따라 적절한 주판으로 보정을 수행합니다.
- 귀하의 프로토콜을 선택하고 샘플을 실행합니다.
- 이전 완료로 장비를 청소하십시오.
- 제조 업체의 기준에 따라 진공 라인을 청소하십시오.
- 흐름을 끄고 머리 / 진공 라인을 청소하십시오.
- 소프트웨어 및 컴퓨터를 끕니다.
4. 대표 결과 :
유동세포계측법 결과는 FlowJo 7.6과 얼룩 컨트롤이 객관적으로 게이팅을 설정하는 데 사용되었다를 사용하여 분석했다. 이것을 근거로, 건강한 세포가 히스토그램 및 ROS (산화 스트레스)의 왼쪽에 표시가 오른쪽으로 세포의 변화로 감지되었다. 그림 1은 건강한 고양이 astrocytes에 과산화수소의 효과의 결과를 보여줍니다. FL1에서 데이터는 ROS의 존재를 나타내는 CM - H 2 DCFDA의 강도를 측정하는 데 사용되었다. 예상했던대로, ROS의 높은 금액은 H 2 O 2 대우 샘플에서 발견되었다. 이것은 왼쪽에서 오른쪽으로 형광 강도의 변화로 히스토그램에 표시됩니다. DMEM 대 DPBS 취급 건강한 세포를 비교하면, ROS의 양을 (그림 2)에는 큰 변화가 없었다.
건강한 고양이 astrocytes에서 산화 스트레스의 수준과 건강한 세포에 H 2 O 2의 효과 그림 1. 유동세포계측법 결과. 결과없이 치료 (DMEM)과 세포와 비교하여 H 2 O 2 건강한 세포에 ROS의 수준을 증가시킬 수있다는 것을 나타냅니다.
DPBS와 3hrs에 대한 incubated 건강한 세포에 감지 ROS의 수준의 그림 2. 유동세포계측법 결과.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
바이러스 자주 제안된 메커니즘의 연결 손상이 산화 스트레스 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31 유도. 기본적으로, 그것은 제안 이러한 수산화, 초과 산화물의 음이온, 질산 산화물 및 / 또는 신경에 독성이 과산화수소, 같은 바이러스성 노출을 통해 glia (astrocytes와 microglia)가 릴리스 반응 산소 래디 칼. 마찬가지로, 산화 스트레스는 또한 암페타민 유발 neurotoxicity 2, 6, 17의 주요 pathologic 메커니즘으로 제안되었습니다. 우리 그룹 CNS에 대한 학대의 바이러스와 약물 모두의 영향에 관심이 있기 때문에, 우리는 astrocytes에 초과 ROS의 현재를 결정하는 빠른 선별 검사를 사용하여 선출. 의 연결을 글루타티온의 대부분은 astrocytes 제작한 다음 뉴런 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30로 전달됩니다. 따라서, 산화 스트레스에 astrocytes 역할은 뉴런에 ...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
우리는 이러한 연구들의 관대한 지원 ReadiSorb 제품 감사합니다.
감사의 글
우리는 이러한 연구들의 관대한 지원 ReadiSorb 제품 감사합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| DMEM | Cellgro | 15-013 - CV | |
| 멤 비타민 | Cellgro | 25-020 - CL | 1퍼센트 (V / V) |
| L - 글루타민 | Hyclone | 17 - 605E | 1퍼센트 (V / V) |
| 비 필수 아미노산 | Hyclone | 25-025 - CL | 1퍼센트 (V / V) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (V / V) |
| 필수 아미노산 | Cellgro | 25-030 - CL | 0.2 % (V / V) |
| 500ml 진공 여과 시스템 | VWR | 87006-076 | |
| 15 ML 원뿔 튜브 | 매 | 352097 | |
| 75cm 두 조직 문화 flasks | 매 | 353136 | |
| 6 잘 조직 배양 플레이트 | 매 | 353224 | |
| CM - H 2 DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium의 이우 (PI) | 시그마 | P4170 - 10mg | |
| 트립신 | Lonza | 17 - 160F | |
| H 2 O 2 | 시그마 | H6520 | |
| HyQ의 항생제 | Hyclone | SV30079.01 | 0.1 % (V / V) |
| G355 - 5 전지 | ATCC | CRL - 2033 | 일반 고양이 뇌 |
참고문헌
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M. Neuropathogenesis of AIDS. Mol Med Today. 2, 16-23 (1996).
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
