utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 표현을 조작할 수있는 능력은 여러 개발 경로의 해설로 이어지는, 현대 실험 발생학의 초석입니다. 몇몇 강력하고 잘 설립된 유전자 변형 기술은 모두 손실과 이득의 기능 모델의 생성을 허용, 마우스의 유전자 발현 수준을 조작하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나, 마우스 트렌스 제닉의 세대 비용과 시간이 소요 모두이다. 유전자 조작의 대체 방법을 따라서 넓게 모색하고 있습니다. utero에 electroporation 우리가 성공적으로 3,4을 적응 가지고 살고 마우스 배아의 1,2에 유전자 전달의 방법입니다. 그것은 크게 일반적으로 여자는 5에서 사용되는 비켜 electroporation 기술의 성공을 기반으로합니다. 간단히, DNA는 세포로 DNA의 이해 수있게 개발 두뇌와 전류가 발생 세포 점막에 일시 모공의 형성 응용 프로그램의 열려있는 심실로 주입됩니다. 젊은 태아의 타겟팅 초음파 유도 microinjection 프로토콜로 이전 6 설명을 필요로하는 동안 우리 손에, 배아는 효율적으로 배아 일 (E) 11.5 빠르면 electroporated 수 있습니다. 반대로, E15.5은 두정 골과 두뇌에 microinjection을 초래할 이마 뼈 분화의 발병으로 인해 우리가 쉽게 electroporate 수있는 최신 단계이다. 반대로, 망막은 embryogenesis의 끝 부분을 통해 액세스할 수 있습니다. 배아는 배아 또는 출생 후의 초기 기간 동안 어떤 시점에서 수집한 수 있습니다. 기자 구조의 주사 transfected 세포의 식별을 용이하게합니다.
날짜하려면, utero의 electroporation에서 가장 널리 neocortical 개발 1,2,3,4의 분석에 사용되고 있습니다. 최근 연구는 배아 망막 7, 8, 9 및 시상 10,11,12를 타겟으로합니다. 여기, 우리는 쉽게 배아 CNS의 다른 도메인을 대상으로 적용할 수 있습니다 utero의 electroporation 프로토콜의 수정을 제시한다. 우리는이 기술을 사용하여 우리가 배아 telencephalon, diencephalon과 망막을 대상 수있는 증거를 제공합니다. 대표 결과가 처음 우리가 배아 telencephalon의 전구 성숙, 분화 및 마이 그 레이션을 모니터링 수 있도록 측면 심실로의 DNA 구조 표현을 소개하는이 방법의 사용을 보여주는 제공됩니다. 우리는 또한 모니터링하는 diencephalic 핵에 신경을 차별의 철새 경로를 허용,이 기술은 제 3의 뇌실 주위 diencephalic 지역에 DNA를 대상으로하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 우리가 망막 개발에 유전자 발현을 조작의 효과를 분석 있도록 micromanipulators의 사용 우리가 정확하게 subretinal 공간을 포함하는 작은 대상 분야로 DNA 구조를 소개하는 허용 보여줍니다.
프로토콜
1. 유연 체조
- 설정 외과 영역은 그림에서 표시됩니다. 1A,. 설정의 주요 구성 요소는 Eppendorf Femtojet microinjector, 니들 홀더, Leica의 steromicroscope, 광섬유 조명 시스템, 전극과 ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템, 난방 패드 및 isoflurane 마취를위한 기화기와 함께 Narishige의 micromanipulator를 포함합니다.
- 수술 도구를 sonicating에 대한 Metriclean2 낮은 거품 솔루션을 사용하여 Bransonic 초음파 클리너 모든 도구를 청소하십시오. autoclaving하여 도구를 소독. 소독 도구는 다음 Germex에 보관됩니다.
- 따뜻한 무균 식염수와 멸균 Lactated 링어의 솔루션과 주사기를 준비합니다.
2. 마취
- 소형 (12cm X 20cm) 마취 챔버 내부 플레이스 동물. 기화기를 사용 1L/min (그림 1A, A ')에서 5% isoflurane 마취와 산소를 제공합니다. 특히, 청소 시스템을 사용 isoflurane 배기 가스를 수집하는 것이 중요합니다.
- 호흡은 깊고 정규된다 챔버에서 동물을 제거합니다. 발가락이 아파와 눈 깜박임 반사 테스트는 전체 마취를 보장하는 데 사용됩니다.
- 손난로 (37 ° C)의 위에는 다시 임신에 마우스를 놓으십시오. 손난로 처음 70 % 에탄올로 닦고 소독을하고, 다음 소독, lintless 거즈 패드로 덮여 있습니다. 인공 호흡기 튜브 및 수술 기간 동안 (2.25 %) isoflurane 제공하기 위해 마스크 장치를 사용하십시오.
- 목 목덜미의 피부 밑에 subcutaneously buprenorphine을 (0.1mg/kg의 체중) 주사.
- 깊고 정기적인 호흡에 대한 수술을 통해 동물을 모니터링합니다. 동물, 말하다 shallowly 또는 빠르게 숨을 못한다. 얕은, 빠른 호흡은 빛이 마취의 표시 수 있으며, isoflurane의 흐름이 증가한다. 동물이 말하다하기 시작하면, isoflurane의 흐름을 줄일 수 있습니다. 호흡 체포의 경우, isoflurane을 해제하고, 동물이 복구까지 산소의 흐름을 향상시킬 수 있습니다. 낮은 농도에서 isoflurane 다시 시작합니다.
3. 수술 동물 준비
- 테이프는 가열 패드로 동물의 앞발과 무딘 포셉와 뒷다리 다리를 곤란하게하여 철회 응답을 다시 확인하십시오.
- 멸균 솜 면봉 스쳐를 사용하여 복부에 depilatory 크림의 두꺼운 층 (즉, 나이르)을 확산. 회사 스트로크에서 underfur 완전히 코팅되어 있는지 확인하십시오. 머리 제거를위한 살균 깨끗한 면봉과 함께 일시적으로 점검, 3 분 평균에 둡니다. 멸균 물을 멸균 거즈 패드를 젖은 모든 흔적들이 갈 때까지 복부를 닦아냅니다. 물 chlorhexidine (즉, Stanhexidine) 피부가 깨끗하고 등을 통해 반복합니다. 청소, 멸균 거즈로 복부를 건조시킵니다.
- 더 멸균 물 다음 chlorhexidine (즉, Stanhexidine)와 절개 사이트를 소독. 청소, 멸균 거즈로 복부를 건조시킵니다. 70 % 에탄올과 신선한 멸균 면봉을 사용하여이 단계를 반복합니다.
- 자궁 뿔이 수술 중에 뽑아하게됩니다 통해 중앙에 슬릿과 복부를 통해 멸균 거즈 패드를 놓습니다.
4. 절개와 자궁 달린 노출
- 자궁 뿔를 노출하려면 먼저 정중선에서 피부 아래에 희미한 선이으로 linea 알바를 찾습니다. 포셉를 사용하여, 멀리 복벽의 피부를 당겨 피부 가위 (길이 약 1cm)로 중간 복부 아래쪽에서 작은 직선 절개를 잘라.
- 곡선 집게와 가위를 사용하여 복막으로 과정을 반복합니다.
- 절개를 통해 작은 수직 슬릿과 멸균 거즈를 삽입하고 따뜻하게 무균 식염수에 저해할 수.
- 절개로 포셉 슬라이드와 자궁을 찾습니다. 자궁 뿔을 제거하는 동안 집게와 오픈 절개를 잡아.
- 조심스럽게 첫 번째와 두 번째 보이는 태아의 자궁을 파악하고 거즈로 배아를 가져옵니다. , 자궁 뿔의 양면을 제거 멸균 거즈에 넣어하고 resorptions 또는 "건강하지 못한"(예 : 작은 바디 크기) 배아를 지적, 배아의 수를 계산합니다. 생리와 자궁 뿔이 젖은 조심스럽게 복부에 자궁의 절반을 반환합니다.
5. 심실로 DNA의 주입
- 외과 바늘은 모세 혈관과 borosilicate micropipettes를 사용하여 셔터 플라밍 Micropipette의 풀러와 함께 준비하고 있습니다 (프로그램 : 열 = 750 = 30 당겨, 벨 = 90 시간 = 150). 멸균 메스 블레이드를 사용하여 바늘 끝이 부드럽게 각도는 45도 이내에서 하차 면도 있습니다.
- 바늘을로드하려면, 파스퇴르 pipettes은 불꽃 아래 좁은 직경 뽑아 있습니다. . 마우스 피스는 0.01 % 메틸 그린과 혼합 3mg/ml 내독소 무료의 DNA ~ 10 μl (메틸 녹색 염료는 DNA를 주사를 시각적으로 수 있습니다 참고) 세우도록 로딩 피펫에 첨부되어 가득 바늘은 다음 micromanipulator 스탠드에 장착하고 Femtojet 인젝터에 붙어있다.
- 난소에 가장 가까운 배아를 시작으로, 원형은 포셉그것이 주사가 꼬리 방향으로 주동이의 발생 수 있도록, "얼굴 앞으로"위치되도록 부드럽게 decidua 내에서 배아를 설정하는 데 사용됩니다. 조명을위한 광섬유 광원이 주동이의 지역에서 대형 측면 심실 (그림의 1B, B ')의 어귀있는 배아 뇌의 정중선을 시각화하는 데 사용됩니다.
- 배아는 원형 집게를 사용하여 위치에 개최됩니다. 두뇌에 항목의 각도는 약 45도되도록 바늘은 자궁 위에 위치합니다. micromanipulator, 그리고 신속하고 지속적인 운동을 사용하여 바늘 끝은 질 벽에 통해 배아의 측면 뇌실에 삽입됩니다. 주사는 측면 심실, 3 뇌실이나 각각 telencephalon, diencephalon과 망막을 대상으로 subretinal 공간으로 이동합니다. 배아 두뇌 vesicles는 DNA 측면 심실로 주입은 제 3의 꽂혔어 흐름을 것입니다 이러한 초기 배아 단계에 개방됩니다.
- Eppendorf Femtojet microinjector를 사용하여 내독소없는 DNA (1-3 μL)를 주입하기 위해 발 페달을 누르십시오. 성공적인 주사가 태아의 뇌 심실 내내 메틸 녹색 염료의 확산에 의해 쉽게 시각이다. 바늘 그런 다음 천천히 파손을 방지하기 위해 백업 도면에 의해 제거됩니다.
6. Electroporation
- 주입 배아 (여전히 자궁 내에서)은 어머니의 복부와 예열 식염수에 충분히 젖었 overlying 멸균 거즈에 위치합니다. 참고 ** 멤브레인 표면에 염분의 덧셈 전류의 효율적인 통과를 허용하는 것이 필수적입니다.
- GenePaddle 전극은 DNA의 주입 다음과 같은 자궁을 그립하는 데 사용됩니다. 40 50V 및 50 MS의 다섯 제곱 전기 펄스는 ECM8300 BTX의 electroporation 시스템 (그림 1C, C ')를 사용하여 초 당 하나의 펄스의 속도로 전달됩니다.
- 보호 서부 유럽 표준시 거즈로 주입 / electroporated 배아를 커버하고 다음 배아를 진행합니다.
- 모든 원하는 배아의 주입 / electroporation 완료되면 조심스럽게 복부 (그림의 1D)로 다시 자궁 뿔 밀어.
- 조심스럽게 다른 자궁 경적을 제거하고 난소에 가장 가까운 배아와 함께 다시 시작합니다.
7. 봉합 및 Stapling
- 일단 모든 배아 다시 자궁 안으로, 복강 ~ 2-3 ML 따뜻한 호수에 추가됩니다.
- 상처를 닫으려면, 복부에 거즈를 제거하고 복막의 측면을 식별하여 시작합니다. 블랙 꼰 실크 라인을 사용하여 복막을 suturing 시작합니다. 그것은 그것이 일반적으로 약한이며 이후 수술 출혈과 감염을 초래할 수 있으므로이 절차에 대한 흡수성 봉합사를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 흉골에 가장 가까운 복막에 선을 정박하고 멀리 앵커에서 스티치로 진행합니다. 모든 봉합이 꽉 있으며, 더 근본적인 기관이나 피부가 실수로 복막에 수놓은하지되었는지 확인하십시오. 나머지 봉합사 라인을 클립 및 폐기.
- 당겨 피부는 집게와 봉합 라인을 넘어 마감했다. 리플렉스 9mm ™ 피부 폐쇄 스테이플을 사용하여, 스테이플 봉합 라인 아래를주의하지 복용, 상처 부위 피부를 클립, 또는 너무 단단히 피부를 당겨 수 있습니다. 선호하는 방법은 집게로 신체의 피부를 멀리 보유하고 주식 도구를 사용하여 90도 각도로 들어올 수 있습니다. 상처가 닫힐 때까지 계속 (약 3 스테이 플스). 끝나면, 스테이 플스가 조심스럽게 봉합 도구 (그림 1D ')와 함께 누르면 작아 보장합니다.
8. 포스트 외과 케어
- 마취 복구를 모니터링하려면, 그녀의 뱃속에 여성 켜고 끌 isoflurane 설정합니다. 숨쉬기가 장치 내부에 동물의 얼굴을 유지 마취에서 회복을 도와 ~ 3 %까지 산소를 켜십시오. 동물은 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드 위에 깨끗한 마른 거즈 패드에 배치해야합니다.
- 동물이 얼떨떨해지만, 동물의 목 피부 아래에 subcutaneously 2 ML 링어의 솔루션을 주입.
- 라우스 동물을 위해 몇 분 온난 화 거즈 패드에 대한 산소의 흐름에 따라 동물을 들고 계속합니다. 그것이 정상적인 호흡 패턴으로 돌아갑니다으로 동물의 운동 부족 spurts을 관찰해야합니다. 동물 의식이 정신 보인다 때까지 몇 분 동안 관찰.
- Gentamicin 스프레이와 함께 여성의 복부를 뿌려서 살균 거즈 패드에있는 동물을 바꿈.
- autoclaved 침구와 판지 주택 살균 케이지로 동물을 전송합니다.
- 워터 병은 철저하게, 세척 소독 및 멸균 물을 가득해야합니다. 물 500 ML은 sulfamethazine 항생제 (25 % 주식) 2 ML를 추가합니다.
- 0.05 MG / kg subcutaneously buprenorphine 아침 다음과 같은 수술을 관리할 수 있습니다.
- 처음 24 시간 후 수술 밀접하게 여성을 모니터링합니다. 동물 이상 24 시간 이상 보관하는 경우, 여성은 새로운 동생이야 이동됩니다일 2 일 연습장.
9. 대표 결과
네크로 텍스
네크로 텍스 시각과 sensorimotor 처리와 높은인지 기능을 담당하는 CNS의 지역입니다. 이것은 각각의 지느러미와 복부 telencephalon에서 파생됩니다 glutamatergic 프로젝션 뉴런과 GABAergic interneurons 구성되어 있습니다. neocortical 개발에 여러 유전자의 역할을 해결하기 위해, 우리는 하나 misexpress에 utero의 electroporation에 사용하거나 지느러미 또는 복부 telencephalon 1,3,4 다른 유전자 (즉, shRNA 구조를 사용하여) 표현을 차단합니다. 배아 telencephalon의 유전자를 misexpress 위해, 우리는 CMV - βactin 발기인 - 확장기 및 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) - 향상된 녹색 형광 단백질이 포함된 bicistronic 표현 벡터 (pCIG2)를 사용 (EGFP를, pCIG2)를 카세트를 transfected 수 세포 epifluorescence (그림 2A - C)에 의해 감지합니다. 우리는 E11.5에서 E15.5 (.; 그림 2 그림 데이터가 E12.5에 있습니다)에 telencephalon로 표현 구조를 소개하기 위해이 기술을 사용합니다. 배아는 몇 일 후 electroporation을 개발함으로써, 우리는 GFP - 표시된 progenitors의 분화 및 마이 그 레이션을 추적할 수 있습니다. 차별화의 진행으로 3 일 후 electroporation GFP + 세포가 차별과 심실 구역 (VZ), subventricular 영역 (svz)과 중간 영역 (이즈)과 대뇌 피질의 플레이트 (CP.; 그림 2C) 밖으로 마이 그 레이션. , 기초 progenitors (즉, Tbr2; E12.5에서 electroporated 두뇌가 24 시간 후에 분석하는 경우, 우리는 혀끝의 progenitors의 표시와 함께 공동 라벨 (. 그림 2A 즉, Pax6)에 의해 전구 성숙과의 연결을 마이 그 레이션에 앞서 이벤트를 모니터링할 수 있습니다; . 그림 2B)와 postmitotic neocortical 뉴런 (즉, Tbr1;. 그림 2C).
Diencephalon
시상 하부는 내분비 및 자율 신경 시스템 사이의 게이트웨이로서 CNS 및 기능의 복부 기지에 자리잡고 있습니다. 개발하는 동안, 성숙 시상 하부를 구성하는 여러 핵은 일반 전구 영역에서 차별되는 라인 배아 diencephalon의 복부 - 대부분의 지역. 현재, 전구 세포의 증식, 분화의 연결 및 hypothalamic 핵의 형성을 조절 분자 경로가 제대로 이해하고 있습니다. 우리는 E12 embryos.We의 제 3 뇌실에 DNA를 주입하여 배아 diencephalon에 리포터 유전자 발현을 대상으로 utero의 electroporation에 사용되는 다음 E14에서 뉴런을 차별에서 GFP의 분포를 따랐다. 이 방법론으로, 우리는 성공적으로 시상 사전 시상과 시상 하부 (그림 3A)에 GFP 발현을 목표로합니다. 코로나 섹션 분석은 우리가 성공적으로 전구 세포에 GFP 발현을 타겟으로 가지고 공개되는 핵을 형성하는 맨틀 영역 밖으로 마이 그 레이션 3 차 뇌실과 뉴런의 라인 심실 영역 (그림 3B)
망막
망막이 뇌에 전달 전기 자극 빛을 광자 변환에 대한 책임 눈 신경 계층입니다. 그것은 배아 diencephalon의 outpocketing로 개발하고, 따라서, 신경 튜브에서 파생됩니다. 신경 망막은 subretinal 공간, 머리 mesenchyme에서 시선을 구분하는 캐비티에 인접 거짓말을 꼭대기의 시조 구획에서 개발하고 있습니다. 망막 progenitors로 DNA 구조를 타겟팅하면 따라서 주사가 작은 대상 영역으로 만들어집니다이 필요합니다. micromanipulators를 사용하여, 우리는 성공적으로 (; 그림 4. 그림은 mCherry 기자와 PCIC의 E15.5 electroporations입니다) E13.5 E15.5에 배아에서이 작은 지역을 타겟으로 관리합니다. ; electroporated retinae 24 시간 이후 transfection을 검사하는 경우, 우리는 대부분의 mCherry + 세포가 외부 neuroblast의 나누어 progenitors이있는 레이어 (onbl), 그리고 망막 신경절 세포 레이어에 (삽입된 페이지 이미지 gcl)에 위치하고 있습니다 관찰 postmitotic 세포는 어디에 집중.
그림 1. utero의 electroporation 설정과 방법론의 소개가. (A) 설정 수술의 주요 구성 요소는 Eppendorf Femtojet microinjector (1), 바늘 홀더 (2) Narishige의 micromanipulator, Leica의 steromicroscope (3), 광섬유 조명을 포함 시스템 (4), 전극 (5)와 손난로 (6)와 ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템. (A ') 동물 isoflurane 마취에 대한 기화기를 사용하여 anesthetized 있습니다. (B, B ') 간단히 마취 후, 자궁 뿔은 노출과 빠른 그린과 혼합 DNA는 배아 두뇌 vesicles로 주입됩니다. 성공적인 주사는 빠른 녹색 염료 (B ')의 추적에 의해 시각입니다. DNA가 성공적으로 주입되면 (C, C '), 외륜의 전극은 자궁, positi의 양쪽에 배치됩니다DNA가 선택의 두뇌 지역에 긍정적인 극으로 뽑았 수 있도록 배아를 oning. (D, D ') 모두 원하는 배아가 주입되면 자궁이 복부 (D)으로 반격에 나섰고이며, 복막을 봉합하고, 피부 (D 붙인 것입니다'). 임신 여성은 다음 복구할 수 있으며 electroporated 새끼가 원하는 시간 지점에서 수집하고 있습니다.
그림 2. pCIG2와 E12.5에 electroporated E13.5 등의 telencephalon 통해 코로나 섹션의 지느러미 telencephalic electroporation의 대표적인 예라고 할 수 있습니다. (AC)는 현미경 사진. Electroporated GFP + 세포 꼭대기의 progenitors의 마커 자신의 표현에 대한 분석입니다 (Pax6 +, 빨강, A), 기초 progenitors (Tbr2 +, 빨강, B)와 postmitotic의 뉴런 (Tbr1 것은 +, 빨강, C). CP, 피질 판, svz, subventricular 지대, VZ, 심실 영역.
그림 3. diencephalic electroporation의 대표적인 예라고 할 수 있습니다. pCIG2와 E12에서 electroporated되었습니다 E14 두뇌의 (A) 복부 볼 수 있습니다. GFP epifluorescence은 시상에서 볼 수있다, 사전 시상과 시상 하부는 제 3 뇌실의 전반에 걸쳐 플라스미드 microinjected pCIG2의 확산을 보여주는. electroporated 두뇌를 통해 코로나 섹션 (B) 현미경 사진, GFP의 마이 그 레이션을 보여주 + 심실 영역과 hypothalamic 핵이 형성되는 맨틀 영역에 세포 밖으로. 3V, 셋째 뇌실, T, 시상, HY, 시상 하부, mz, 맨틀 구역, 전화 번호, telencephalon; PreT, prethalamus, VZ, 심실 구역.
그림 4. 망막 electroporation의 대표적인 예라고 할 수 있습니다. 외부 neuroblast 계층에 mCherry + 세포의 축적을 보여주는 E15.5에서 PCIC와 electroporated E16.5 눈에 코로나 섹션되지 Brn3b + 신경절 세포 레이어에 망막 신경절 세포. 삽입된 페이지는 박스 영역의 높은 배율 이미지입니다. gcl, 망막 신경절 세포 레이어, 레, 렌즈, onbl, 바깥쪽 neuroblast 레이어, 다시, 망막.
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토론
utero에 electroporation은 개발 프로세스의 다양한 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, GFP, mCherry 또는 알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 기자 유전자의 transfection은 혈통의 연결을 추적 및 마이 그 레이션 실험을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 또는, Cre 호텔 recombinase는 transiently 선택 공간 및 / 또는 temporally 제어 방식으로 floxed allele를 제거하는 표현하실 수 있습니다. 또한, shRNA 또는 지배 구조는 부정적인 최저 목표 유전자 기능 electroporated 수 있습니다. 마지막으로, 야생 입력 및 / 또는 유전자 돌연변이 마우스 라인 모두에서 대상 overexpression 또는 키 유전자의 misexpression은 세포 운명 결정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 매우 짧은 시간에 요소의 여러 조합의 시험을 허용 본 분석의 높은 처리량이 중요합니다. 주의 중 하나 참고이 절차는 세포에서 ...
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 CS 실험실에서 utero의 electroporation 기술의 확립에서 초기 작업에 에바 Hadzimova, 피에르 Mattar과 크리스토퍼 코바치 감사하고 싶습니다. 이 작품은 캐나다 보건 연구소 연구소 (CIHR) 부여 (청소 44,094)과 DMK에 CS와 알버타 아동 병원 연구 재단 부여 팀 그랜트 (00933-000)을 신흥 CIHR / 재단 파이팅 실명 (FFB)에 의해 재정 지원되었다. RD가 CIHR 캐나다 희망 장학금 지원 되었음 RC는 FFB의 학생이기 지원하고 LML은 유전학에 CIHR 교육 그랜트와 아동 발달 지원했다.
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참고문헌
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