FlexStation 3을 사용 TRP 채널 기능의 높은 처리량 검사하는 매체를위한 셀 기반의 칼슘 분석

요약

이 동영상은 FlexStation 3을 사용 인간 TRPA1 채널의 약리 프로필을 공부에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 준비, 염료 로딩과 microplate 리더 FlexStation 3 작업의 세부 사항을 다룹니다.

초록

분자 장치 'FlexStation 3 멀티 잘 접시에 자동 형광 측정 가능한 benchtop 다중 모드 microplate 리더입니다. 그것은 학술 설정에서 중간에 높은 처리량 화면에 이상적입니다. 그것은 멀티 채널 pipetter과 기계가 형광 시약의 다양한 형광 변화를 모니터링하기 위해 한 번에 한 컬럼을 읽고 갖춘 통합 유체 전송 모듈이 있습니다. 예를 들어, FlexStation 3 ⁺ - 투과 이온 채널과 G 단백질 결합 수용체 세포 무료 칼슘 ^{2 +} 수준의 변화를 측정하여 칼슘 ^2의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 과도 수용체 잠재적인 (TRP) 채널은 많은 생리와 pathophysiological 기능에 중요한 역할을 nonselective 양이온 채널의 큰 가족입니다. TRP 채널의 대부분은 칼슘 투과하고 활성화시 칼슘 유입을 유도. 이 비디오에서는, 우리는 TRPA1 채널, 다양한 유해 자극에 대해 분자 센서의 약리 프로필을 공부 FlexStation 3 응용 프로그램을 보여줍니다. transiently 또는 안정 96 - 웰 플레이트에서 자란 인간 TRPA1 채널을, 표현 HEK293 세포가 ⁺ 민감한 형광 염료 칼슘 ^2, Fluo - 4, 이러한 세포의 실시간 형광 변경 로드된은의 적용 전과하는 동안 측정 FlexStation 3 플렉스 모드를 사용하여 TRPA1 아고 니스트. putative TRPA1 길항제의 영향도 조사했다. 데이터는 TRPA1 activators와 억제제의 농도 - 반응 관계를 구축하기 위해 SoftMax Pro 소프트웨어에서 전송됩니다.

프로토콜

1. 96 - 웰 플레이트에 셀 준비

transiently cDNA 인간 TRPA1와 trasfected HEK293 세포에 대한

1. HEK293 세포는 10 %의 열 inactivated 태아 소 혈청 (Invitrogen, 16000-044)와 보충 4.5 MG / ML 포도당 (써모 과학, SH3002201)이있는 Dulbecco의 최소 필수 매체 1~2일 (DMEM), 50 단위 재배 / ML 페니실린 50 μg / ML 스트렙토 마이신 (Invitrogen, 15140-163). transfection의 날, 세포 밀도는 70-90%에 도달해야합니다.
2. 각 물론 50 μl 폴리 - L - ornithine (시그마 P3655, 멸균 증류수에 20 μg / ML)를 pipetting 37에서 잠복기 ° C를 최소한 15 분에 의해 외투 96 - 웰 플레이트. Dulbecco의 인산 각각 잘 한 번 씻어도 ^MG이없이 살린 (DPBS)를 버퍼 ⁺ 및 CA ^{2 +} (써모 과학, SH3002803). 번호판은 몇 시간 동안 세포 배양 후드에 남아있을 수 있습니다.
3. 96 - 웰 플레이트 모든 잘 들어, 1.5 ML E....

토론

세포내 칼슘 ^{2 +과} 같은 신경 전달 물질 릴리즈 (3), 심장 활동 전위 (4), 근육 세포 수축 (5), 세포 신호 전달 (6-7) 및 excitotoxic 세포 죽음 (많은 생리와 병리 학적 조건에서 중요한 역할을 담당 8). 세포내 칼슘 ^{2 +} 수준의 측정 기능 ⁺ - 투과 채널 플라즈마 막이나 세포 organelles에서 칼슘 ^2의 변화와 공헌을 명료하게하다하는 데 도움이
위의 프로세스 (9-13)에 CA ^{2 +.} 분석은 또한, 그 중 많은 G - 단백질 결합 수용체의 기능을 조사 활성화에 따라, ⁺ 상점 세포내 칼슘 ² 칼슘 ^{2 +를} 방출 또는 다른 칼슘 ² 활성화하여 세포내 자유 칼슘 ^{2 +} 농도를 증가로 이어질하는 데 사용할 수 있습니다 ⁺ 투과 이온 채널 (14-16). FlexStat.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
FlexStation 3	분자 장치	FLEX3
96 - 음, FlexStation의 Pipet 도움말	분자 장치	9000-0912
96 - 웰 플레이트	그라 이너 바이오 - 원	655090
96 - 웰 지우기 플랫 바텀 플레이트	코스타	3595
DMEM	Invitrogen	12430-104
Opti - 멤	Invitrogen	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
AM Fluo - 4	Invitrogen	F14202
PluronicF - 127	Invitrogen	P3000MP
폴리 - L - ornithine	시그마	P36551
probenecid	시그마	P8761
소 혈청 알부민	시그마	A9418