갇힌 화합물의 광분해는 다양한 생리학 활성 화합물의 농도에 신속하고화된 증가의 생산 수 있습니다. 여기, 우리는 갇힌 캠프의 광분해와 함께 또는 dissociated 마우스 후각 감각 뉴런의 후각 전달 연구를위한 CA를 갇힌 패치 - 클램프 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
갇힌 화합물의 광분해는 다양한 생리학 활성 화합물 1의 농도에 신속하고화된 증가의 생산 수 있습니다. 갇힌 화합물은 자외선의 플래시에 의해 부러진 수있는 화학 케이지에 의해 만들어진 분자 생리학 비활성됩니다. 여기, 우리는 dissociated 마우스 후각 감각 뉴런의 후각 전달의 연구 갇힌 화합물의 광분해와 함께 패치 - 클램프 녹음을 얻는 방법을 보여줍니다. 후각 전달의 과정 (그림 1) 수용체에 바인딩 odorant는 주기적 염기 - 게이트 (CNG) 채널 2를 열어 캠프의 증가로 연결 후각 감각 뉴런의 속눈썹에서 열립니다. CNG 채널을 통해 CA 항목은 CA - 활성화 망할 CIA 채널을 활성화한다. 우리는 마우스 후각 상피 3 방법에 갇힌 CAMP 4 광분해 또는 칼슘 5 갇힌하여 CNG 채널 또는 CA - 활성화 망할 CIA 채널을 활성화에서 신경을 떼어 놓다하는 방법을 보여 </>를 한모금. 우리는 패치 - 클램프 녹음이 전체 셀 전압 클램프 구성 8-11에서 전류를 측정하기 위해 이동하는 동안 우리에서 내놓다 캠프 CA에 ciliary 지역 자외선 섬광을 적용하기 위해 플래시 램프 6,7을 사용합니다.
프로토콜
1. 기기 및 장비
- 케이지 화합물의 광분해에 대한 후각 신경세포의 반응을 측정하기 위해, 패치 클램프 증폭기, 기록 전극 및 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결된 참조 전극, 디지타이저, 컴퓨터, 데이터 수집용 소프트웨어, 마이크로 조작기, 형광 현미경, 관류 시스템, 진동 방지 테이블 및 패러데이 케이지를 포함하는 전형적인 패치 클램프 기록 시스템과 함께 플래시 램프를 사용합니다(그림 2).
- 고강도 자외선(UV) 플래시를 생성하기 위해, 제논 가스가 충전된 쇼트-아크 플래시 튜브에 고전압 커패시터를 방전시키는 방식으로 작동하는 제논 플래시 램프(Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit, 그림 3A)를 사용합니다6-7. 빛 플래시는 수동으로 또는 전기생리학적 수집을 제어하는 동일한 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터로 트리거할 수 있습니다.
- 언케이지(uncaging) 응용 분야에 최적화된 UV 쇼트 패스 필터(270-390 nm)를 플래시 램프의 출력 슬롯에 삽입하고, 쿼츠 광섬유 라이트 가이드를 현미경에 연결합니다(1.5 참조).
- 빛 플래시의 강도, 따라서 광분해의 정도는 특정 파라미터를 변경하여 조절할 수 있습니다:
전압 또는 커패시턴스6. 실제로 ....
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토론
패치 - 클램프 녹음과 함께 갇힌 화합물의 플래시 광분해은 생리학적으로 활성 분자 내부와 외부에서 세포 모두의 농도에 신속하고 현지 점프를 얻을 수있는 유용한 기술입니다. 갇힌 compounds1 여러 종류의 합성되었으며,이 기술이 활성화하거나 사용 가능한 갇힌 화합물 11 일부 광분해에 의해 변조된 수있는 이온 채널을 표현 교양 세포를 포함한 세포의 다양한 유형에 적용할 수 있습니다.
갇힌 화합물의 광분해은 짧은 시간에 분자의 충분한 양의 우리에서 내놓다 근처 자외선의 높은 강도의 펄스를 필요로합니다. 다양한 광원을 사용할 수 있습니다 : 지속적으로 운영 수은 또는 크세논 아크 램프 (LED 셔터에 의해 제어 및 현미경, 지논 플래시 램프, 자외선 레이저, 그리고 최근에 개발된 고전력 자외선 발광 다이오드의 epifluorescent 포트에 결합 ). 광원의 각 유형의 장점과 disadvan있다특정 응용 프로그램 및 장치의 비용에 따라 tages. 플래시.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 장비 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 현미경으로 어댑터 모듈 플래시 램프 | Rapp 광전자 | FlashCube 70 | |
| 에어 테이블 | TMC | MICRO - G 63-534 | |
| 디지타이저 | 축삭 인 스트 루먼트 | Digidata 1322A | |
| 데이터 수집 소프트웨어 | 축삭 인 스트 루먼트 | pClamp 8 | |
| 데이터 분석 소프트웨어 | WaveMetrics | 이고르 | |
| 어댑터 모듈 미러 | Rapp 광전자 | M70/100 | |
| 전극 홀더 | 축삭 인 스트 루먼트 | 1 - HL - U | |
| 패러데이의 새장 | 사용자가 만든 | ||
| 필터 큐브 | 올림포스 산 | U - MWU | 여기 필터를 제거 |
| 섬광등 | Rapp 광전자 | JML - C2 | |
| 집게 뒤몽 # 55 | 세계 정밀 계측기 | 14,099 | |
| 유리 모세관 | 세계 정밀 계측기 | PG10165 - 4 | |
| 유리 바닥 요리 | 세계 정밀 계측기 | FD35 - 100 | |
| 조명기 | 올림포스 산 | 하이라이트 3100 | |
| 거꾸로 현미경 | 올림포스 산 | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & 노이만 | SM I | |
| Micropipette 풀러 | Narishige | PP - 830 | |
| 모니터 | HesaVision | MTB - 01 | |
| 중성 농도 필터 | 오메가 광학 | 다양 | |
| 목표 100X | 자이스 혈구 | Fluar 440,285 | 자이스 혈구 또는 Olympu 중의 |
| 목표 100X | 올림포스 산 | UPLFLN 100XOI2 | 자이스 혈구 또는 올림푸스 중 |
| 광학 UV 필터 shortpass | Rapp 광전자 | SP400 | |
| 패치 - 클램프 증폭기 | 축삭 인 스트 루먼트 | Axopatch 200B | |
| 포토 다이오드 조립 | Rapp 광전자 | PDA | |
| 석영 라이트 가이드 | Rapp 광전자 | 다양 | 우리는 600 μm의 직경을 사용하여 |
| 실버 와이어 | 세계 정밀 계측기 | AGT1025 | |
| 실버 지상 펠릿 | 워너 악기 | 64-1309 | |
| 크세논 아크 램프 | Rapp 광전자 | XBL - JML |
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 |
|---|---|---|
| BCMCM - 갇힌 CAMP | BioLog | B016 |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 시그마 | A8806 |
| CaCl2 표준 용액 0.1 M | Fluka | 21,059 |
| 갇힌 CA : DMNP - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Invitrogen | D6814 |
| 시스테인 | 시그마 | C9768 |
| Concanavalin A 형 V (ConA) | 시그마 | C7275 |
| CsCl | 시그마 | C4036 |
| DMSO | 시그마 | D8418 |
| DNAse I | 시그마 | D4527 |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | 시그마 | E9884 |
| EGTA | 시그마 | E4378 |
| 포도당 | 시그마 | G5767 |
| HEPES | 시그마 | H3375 |
| KCl | 시그마 | P3911 |
| 코이 | 시그마 | P1767 |
| 류펩틴 | 시그마 | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63,020 |
| Papain | 시그마 | P3125 |
| 폴리 - L - 라이신 | 시그마 | P1274 |
| NaCl | 시그마 | S9888 |
| NaOH | 시그마 | S5881 |
| NaPyruvate | 시그마 | P2256 |
참고문헌
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett
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