Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을 입증 체외에서.
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이 논문에서
요약
초록
retroviruses의 게놈은 지질 봉투에 둘러싸인 capsid으로 쌌다는 것입니다. 이러한 HIV - 1과 같은 lentiviruses, 들어, 원뿔 capsid의 껍질은 육각의 격자로 배열 CA 단백질로 구성되어 있습니다. capsid는 원추 1, 2의 좁은 끝에 7 광범 끝에 pentamers와 5 닫힙니다. 이 capsid의 쉘으로 쌌다는 바이러스 ribonucleoprotein 복합이며, 함께 그들은 코어를 구성.
대상 세포막과 바이러스 세포막의 융합에 따라, HIV - 1은 세포질에 발표됩니다. capsid 다음 uncoating이라고도 과정에서 용해 형태로 3 무료 CA를 방출 disassembles. HIV - 1 uncoating의 세포내 위치와 타이밍을 제대로 이해하고 있습니다. capsid의 안정성을 변경 CA에서 단일 아미노 산 대체는 또한 세포 4 감염 HIV - 1의 능력을 손상. 이것은 capsid의 안정성은 HIV - 1 감염에 대해 중요한 것을 나타냅니다. HIV - 1 uncoating이 프로세스에 대한 민감하고 안정적인 assays의 가용성의 부족으로 인해 공부를 어렵게되었습니다. 여기 감염 HIV - 1 입자로부터 분리된 코어를 사용하여 체외에서 uncoating 공부를위한 양적 방법을 설명합니다. 접근 방식은 추위에 세제의 계층 통해 선형 자당 기울기에 집중 virions의 침강에 의해 코어의 고립을 포함한다. uncoating 계량하려면, 분리된 코어는 37 incubated 아르 ° C 각종 초과 간격 및 ultracentrifugation에 의해 연속적으로 pelleted하십시오. uncoating의 범위가 뜨는에서 CA의 분율을 quantifying 의해 분석됩니다. 이 접근은 HIV - 1 capsid 안정성 4, 5, 6에서 바이러스 변이의 효과를 분석하기 위해 고용되었습니다. 또한 HIV - 1 uncoating의 세포 요소의 역할을 공부하는 데 유용합니다.
프로토콜
1. HIV - 1 입자의 제작
진행하기 전에 허가를 받아야하고 감염 HIV에 대한 승인 biosafety 시설에서 작업에 기관의 Biosafety 사무실에서 지침을 따르십시오. 그 적절한 치료를 보장해야하며, 안전 조치가 biosafety 연구실에 근무하는 동안 따라하고 있습니다.
HIV - 1 입자의 생산은 일반적으로 칼슘 인산염 transfection 방법 7, 8을 사용하여 HIV - 1 proviral DNA로 293T 세포의 과도 transfection에 의해 수행됩니다. 감염된 T 세포의 문화로 성장 높은 titer의 바이러스 주식도 적합합니다.
- 10% 태아 소 혈청 (FBS)과 항생제로 보충을 포함하는 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 293T 세포 [페니실린 (100 IU / ML) 및 스트렙토 마이신 (100 μg / ML)] 37 ° C, 5 % CO 2에서 .
- 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 종자 2x10 6을 사용 거의 합류 요리에서 세포를 분리
- 다음날, 세포 monolayers이 25 % 정도 ....
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토론
이 메서드는 대상 세포에서 HIV - 1 uncoating을 분석 검증 방법 unavailability 특히 인해 HIV - 1 수명주기의이 단계를 공부하는 데 유용합니다 체외에서 uncoating 공부 HIV - 1 코어를 정화하려면 여기를 설명했다. 이 방법은 코어를 정화 평형 ultracentrifugation를 사용하지만, 다른 사람들이 한때 용해 후 직접 pelleting를 사용한 1퍼센트 트리톤 - X - 100 12, 13 또는 0.1 % 트리톤 - X - 100 14, 15 겹쳐 자당 쿠션을 통해 pelleting.
이 방법에 의해 얻은 코어의 회수는 실험 유사 콘텐츠에 적용됩니다. 이 프로토콜의 성공의 변수는 transfection 효율이다. 일반적으로 우리는 그라디언트에서 p24의 최소 7 μg에 해당하는 바이러스의 수량을로드합니다. 저희 연구실은 바이러스 제작을위한 칼슘 인산염 transfection 방법을 사용합니다.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
HIV - 1 에이 킨 실험실에서 uncoating 연구는 NIH 보조금 AI40364, AI50423 및 AI076121 지원했다. p24 엘리사에 사용되는 시약을 포함한 몇 가지 주요 자료, NIH AIDS 연구 및 레퍼런스 프로그램, 에이즈 학부, NIAID, NIH에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| DMEM | Cellgro | 10-013 - 이력서 | |
| PBS | Cellgro | 21-031 - 이력서 | |
| 트리톤 - X - 100 | Mallinckrodt 베이커 Inc의 | 9002-93-1 | |
| 십대 초반 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Cellgro | 25-053 - CI | |
| 2XBBS | 구성 : 50mM BES [P H 6.95], 280 MM NaCl 및 1.5 MM 나 2 HPO 4. 6.95로 산도를 조정상온에서. 소독 및 -20 ° C.에 aliquots에 저장을 필터 | ||
| 코팅 항체 : p24에 단클론 항체 (183 - H12 - 5C) | NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 | 3537 | |
| 차 항체 : HIV - IG (hyperimmune 인간 환자의 혈청) | NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 | 3957 | |
차 항체 : 염소 안티 인간 IgG, 복합 퍼옥시데이즈 | 찌르다 | 31,130 | |
| HRP 기판 | KPL Inc의 | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 잘 접시 | 써모 과학 | 3455 | |
| SW32Ti 및 SW32.1 티의 로터와 호환 초원 심 분리기 | 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 | ||
| TLA - 55 로터와 탁상 초원 심 분리기 | 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 | ||
| 고속 microfuge 튜브 | 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 | 326823, 358123, 357448 | |
| 자동 Densi 흐름 밀도 구배 fractionator | Labconco 주식 회사 | 4,517,000 | |
| 그라데이션 구 | CBS 과학 주식 회사 주식 회사 | GM - 20 |
참고문헌
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature.
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재인쇄 및 허가
