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방법 논문

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

10.4K 조회수

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DOI:

10.3791/3404

⸱

2011년 12월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Anatomy and Cell Biology, The University of Kansas School of Medicine

이 논문에서

요약

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

초록

서골비기관(vomeronasal organ, VNO)은 동일 종 내 개체들의 사회적, 성적 및 생식 상태에 대한 정보를 담고 있는 화학 감각 신호를 감지합니다 1,2. 페로몬이라고 하는 이러한 종 내 신호와 일부 포식자로부터 오는 신호는 3 매우 높은 특이성과 민감도로 서골비 감각 신경세포(vomeronasal sensory neurons, VSNs)를 활성화합니다 4. 화학 감각 단서를 감지하는 과정을 매개하기 위해 V1R, V2R 및 FPR 5-14의 최소 세 가지 서로 다른 G-단백질 결합 수용체 가족이 VNO 신경세포에서 발현됩니다. VNO가 페로몬 정보를 어떻게 인코딩하는지 이해하기 위해서는, 다양한 자극에 대한 개별 VSN의 반응 프로필을 분석하고 이러한 반응을 매개하는 특정 수용체를 식별하는 것이 매우 중요합니다.

VNO의 신경상피는 한 쌍의 서골(vomer bones)에 둘러싸여 있습니다. VNO의 반맹관 구조는 비강과 연결되는 하나의 개구부(서비관, vomeronasal duct)를 가지고 있습니다. VSN은 수지상 돌기를 VNO의 내강 부분까지 뻗으며, 이곳에서 페로몬 신호가 수지상 돌기 노브(dendritic knobs)에 발현된 수용체와 접촉하게 됩니다. VSN의 세포체는 가층층 구조를 형성하며, V1R과 V2R이 각각 정단층과 기저층에 발현됩니다 6-8. 감각 자극에 대한 VSN의 반응을 모니터링하기 위해 여러 기술이 활용되어 왔습니다 4,12,15-19. 이러한 기술들 중에서 급성 절편 제작법(acute slice preparation)은 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 분리된 VSN 3,17과 비교하여 절편 제작법은 뉴런을 본래의 형태대로 유지하며 세포의 수지상 돌기가 상대적으로 온전하게 보존됩니다. 둘째, 상피 전체나 전체 마운트(whole-mount) 제작법에 비해 12,20 VNO의 관상 절편(coronal slice)에서는 VSN의 세포체에 쉽게 접근할 수 있어 전기생리학적 연구와 이미징 실험이 가능합니다. 셋째, 이 방법은 분자 클로닝 기술과 결합하여 수용체 식별을 가능하게 할 수 있습니다.

감각 자극은 VSN에서 수용체 활성화를 나타내는 강력한 Ca2+ 유입을 유도합니다 4,21. 이에 따라 우리는 VSN을 포함한 후각 sensory neuron에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 마우스를 개발하였습니다 15,22. 이 프로브의 민감도와 유전적 특성은 Ca2+ 이미징 실험을 크게 용이하게 합니다. 이 방법은 이전 연구들 4,21에서 사용된 염료 로딩 과정을 제거하였습니다. 또한 우리는 VNO 절편에 다양한 자극을 가할 수 있는 리간드 전달 시스템을 채택하였습니다. 이 두 가지 기술의 결합을 통해 수많은 자극에 반응하는 여러 뉴런을 동시에 모니터링할 수 있습니다. 마지막으로, 이미지 프로세싱을 돕기 위한 반자동 분석 파이프라인을 구축하였습니다.

프로토콜

1. 용액 준비

  1. 표에 따라 10X R1, 10X R2 및 10X R3 용액을 준비한다.
    R1
    화학 물질MW(g/mol)mM (1X)10X 스탁 (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M 스탁110 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    NaH2PO4·H2O137.991.251.72

    R2
    화학 물질MW(g/mol)mM (1X)10X 스탁 (g/L)
    NaHCO384.012521

    R3
    화학 물질MW(g/mol)mM (1X)10X 스탁 (g/L)
    NaCl58.4412573.05
    KCl74.552.51.86
    MgCl21 M 스탁220 ml
    CaCl2·2H2O147.0222.94
    HEPES1 M 스탁550 ml
  2. 실험 당일에 100 ml의 10X R1과 100 ml의 10X R2를 이중 증류수(DDW)에 섞고, dextrose 1.8 g(최종 10 mM)을 첨가하여 마우스 인공 뇌척수액(mACSF) 1리터를 제조한다. 이 준비 방법은 높은 pH에서 탄산칼슘 침전이 발생하는 것을 방지한다. mACSF의 삼투압은 약 310-315 mOsm/L이다. 필요한 경우 dextrose나 물로 삼투압을 조절한다. 용액의 pH를 7.2-7.4로 조절하기 전, Carboxygen 가스(95% 산소 및 5% 이산화탄소)로 최소 30분 동안 폭기한다.
  3. 실험 당일에 100 ml의 10X R2와 100 ml의 10X R3를 DDW에 섞고, dextrose 1.8 g(10 mM)을 첨가하여 링거 용액(Ringer's solution) 1리터를 제조한다. 링거 용액의 삼투압과 pH는 mACSF와 비슷해야 한다. Carboxygen 가스로 용액을 폭기한다.
  4. mACSF 또는 링거 용액을 사용하여 4% 저융점 아가로스(LMA)를 준비한다. 녹인 아가로스를 에펜도르프 튜브에 소분하여 사용 전까지 4°C에 보관한다. 정제된 다당류로 구성된 LMA는 37°C에서 액체 상태를 유지하며 25°C 이하의 온도에서 빠르게 응고된다. 이러한 특성 덕분에 VNO 및 살아있는 조직의 생리학적 실험을 위한 매립에 이상적이다. 한천(agar)과 같이 불순물이 포함된 다른 재료는 특성이 규명되지 않은 성분이 신경 반응을 방해할 수 있으므로 생체 조직 실험에 선택해서는 안 된다.
  5. 링거 용액으로 페로몬 자극제를 준비한다. 마우스 소변의 경우 1:100 희석 시 강력한 반응이 나타난다.

2. VNO 슬라이스 준비

  1. 동물을 희생시키기 전, LMA 튜브 2개를 가열 블록에 놓고 온도를 >60°C로 설정하여 아가로스를 녹입니다. 겔이 액화되면 튜브를 37°C 가열 블록으로 옮깁니다.
  2. CO2 안락사 후 G-CaMP2 마우스의 머리를 절단합니다. 가위로 하악골을 잘라 아래턱을 제거합니다. 능선 모양의 상구개 조직을 벗겨내어 비강을 노출시킵니다 (그림 1A). 두 앞니 사이에 수술용 칼날을 삽입하여 턱뼈를 분리합니다. VNO가 노출되도록 턱뼈를 조심스럽게 제거합니다. 이때 미골을 잡아당겨 VNO 전체를 비강에서 들어 올릴 수 있습니다 (그림 1B). VNO를 즉시 차가운 산소 공급 mACSF 용액으로 옮깁니다.
  3. 해부 현미경 하에서 #5 핀셋 끝을 사용하여 비중격 뼈 벽을 따라 부드럽게 밀어 두 개의 VNO를 분리합니다 (그림 1C). VNO 조직을 감싸고 있는 서골을 벗겨냅니다. 뼈강에서 VNO 조직 전체를 부드럽게 들어 올립니다. 이 단계에서는 신경상피가 손상되지 않도록 각별히 주의해야 합니다. 조직 표면에 남은 작은 뼈 조각들은 임베딩 전에 완전히 제거해야 합니다. 조직에 남은 조각들이 절단 칼날에 걸려 조직이 아가로스 블록에서 빠져나올 수 있기 때문입니다.
  4. 핀셋으로 VNO 조직의 후단을 잡고 녹은 아가로스에 부드럽게 잠기게 합니다 (그림 1D). 튜브를 얼음 위에서 빠르게 냉각시켜 아가로스를 응고시킵니다. 임베딩 및 냉각 과정은 2분 이내에 완료되어야 합니다.
  5. VF300 조직 절편기 (Precisionary Instruments, Greenville, NC)를 사용하여 절편을 제작합니다. VNO가 포함된 아가로스 블록을 적절한 모양으로 자른 후 조직 홀더에 접착합니다 (그림 1E 및 F). 조직 홀더를 금속 실린더에 삽입하고 남은 챔버 공간을 추가 LMA로 채웁니다. LMA가 얼음 위에서 응고되면 즉시 절편 제작을 진행합니다. 절편 챔버에 차가운 산소 공급 mACSF를 공급하고 슬라이스당 180-200 μm 두께로 절단을 시작합니다. 절단 중에 조직이 압착되지 않고 VNO가 아가로스에서 떨어지지 않도록 이송 속도와 진동 주파수를 조절합니다. 절단된 슬라이스들을 수집하여 mACSF 배양 챔버로 옮깁니다 (그림 2A). 슬라이스는 실온의 산소 공급 mACSF에서 6-8시간 동안 생존 가능합니다. 그림 2B 및 C는 각각 G-CaMP2 VNO 슬라이스의 DIC 및 2-광자 이미지를 보여줍니다.

3. 이미징 챔버 설정

  1. VNO 절편을 관류 챔버(Siskiyou, Grants Pass, OR) 중앙에 배치하고 절편 고정 장치(Warner Instruments, Hamden, CT)로 절편을 눌러 고정합니다(그림 3A). 고정 장치의 실은 절편의 LMA 부분만 눌러야 하며 VNO 조직은 누르지 않아야 합니다. 산소화된 mACSF가 입구 포트를 통해 약 100 μl/sec로 관류 챔버에 공급되며, 액체는 출구 포트의 흡입 바늘을 통해 배출되어 신선한 mACSF가 지속적으로 흐르게 합니다(그림 3A 및 B).
  2. 30 ml 주사기에 링거액을 채우고 주사기 펌프(New Era Pump Systems, Farmingdale, NY)에 고정합니다. 펌프 속도를 300-600 μl/min으로 설정하여 절편 위로 링거액이 지속적으로 흐르도록 합니다(그림 3C).
  3. 링거액의 출구를 HPLC 주입 루프(Chromtech, Apple Valley, MN)에 연결합니다(그림 3D). 전달되는 부피를 정밀하게 제어하기 위해 서로 다른 크기의 루프를 선택할 수 있습니다. 본 실험에서는 20 μl 루프를 사용하였습니다. 주입 루프 컨트롤에는 두 가지 흐름 경로가 있습니다(그림 3E). "load" 위치에서는 Hamilton 정밀 주사기를 사용하여 샘플 루프에 샘플을 채울 수 있습니다. 과잉 샘플은 폐액 출구를 통해 샘플 루프 밖으로 배출됩니다. 주사기 펌프로 주입된 링거액은 샘플 루프를 우회하여 관류 팁에 연결된 출구로 직접 이동합니다(그림 3A 및 E). "injection" 위치에서는 펌프 용액이 샘플 루프를 통해 흐르며 자극 물질을 출구로 밀어냅니다(그림 3E). 이미징 실험 전, 관류액의 원활한 흐름을 보장하기 위해 기포를 제거해야 합니다. 자극 전달을 위해 다른 상용 또는 맞춤형 주입 시스템을 구현할 수도 있습니다.
  4. 5X 또는 10X 렌즈 아래에서 관류 팁이 VNO 절편으로부터 약 1 mm 떨어지도록 조정합니다.
  5. 새로운 관류 시스템을 설정할 때는 형광 염료를 사용하여 샘플 지연 시간과 지속 시간을 측정하는 것이 좋습니다. 0.1% rhodamine 6G 염료를 샘플 루프에 채우고, 이미지 획득 시작 5초 후에 밸브를 주입 위치로 전환합니다(그림 3F). 형광 신호는 10-30초 사이에 검출됩니다. 형광 신호의 매끄러운 곡선은 침수 렌즈 아래에서 난류가 거의 발생하지 않으며 산소화된 mACSF가 절편에 충분히 관류되고 있음을 나타냅니다.

4. 타임랩스 이미징

  1. 타임랩스 이미징을 위해 10X 또는 20X 워터-딥핑 렌즈가 장착된 Zeiss AxioSkope FS2 현미경을 사용합니다. G-CaMP2 신호를 검출하기 위해 표준 GFP 밴드패스 필터(450-490nm)를 사용합니다. 에피형광 이미지는 G-CaMP2의 발현 수준에 따라 1X1 또는 2x2 비닝을 적용하여 CCD 카메라(Zeiss HRM)로 획득합니다.
  2. 획득 속도를 초당 1프레임으로 설정합니다. G-CaMP2 신호의 퇴색과 세포의 광손상을 최소화하도록 빛의 세기를 조절합니다. 각 실험에서 일반적으로 60프레임의 이미지 스택(∼60-70초)을 획득합니다. 모든 시험에서 일관된 시간 지연을 얻기 위해, 한 세트의 실험에서는 특정 시점(예: 그림 3F의 5초 시점)에 밸브를 주입 위치로 전환합니다.
  3. Ringer 용액을 자극제로 사용하여 테스트 런을 수행합니다. 샘플 주입 중에 움직임 아티팩트가 발생하는 경우 관류 설정을 다시 조정합니다.
  4. Ringer 용액에 1:100으로 희석한 마우스 소변을 사용하여 양성 대조군 런을 수행합니다. 마우스 소변에 대한 G-CaMP2 반응의 전형적인 최대 ΔF/F 값은 약 20-40%입니다. 필요한 경우, 실험 종료 시 10 mM KCl이 포함된 Ringer 용액을 투여하여 슬라이스의 생존력을 확인할 수 있습니다.
  5. 자극제를 하나 로딩한 후, Hamilton 시린지를 Ringer 용액으로 최소 3회 세척합니다. 서로 다른 자극제 사이에는 샘플 루프를 Ringer 용액으로 최소 3회 세척합니다. 이 단계들은 서로 다른 샘플 간의 교차 오염을 방지합니다.
  6. 다음 자극제를 적용하기 전, VSN이 회복될 때까지 4-10분 동안 기다립니다.

5. 데이터 분석

  1. 한 슬라이스에서 획득한 모든 이미지의 이미지 등록(image registration)을 수행합니다. 이 과정을 자동화하기 위해 AxioVision (Carl Zeiss, North America)에서 자체 작성한 VBA 스크립트를 사용합니다. 동일한 실험 내의 모든 이미지 프레임은 탄성 등록(elastic registration, 그림 4A)을 통해 선택된 공통 참조 프레임을 기준으로 등록됩니다. 비선형 등록으로도 알려진 탄성 등록은 대상 이미지를 참조 이미지에 비강체적으로 변형시키는 것을 강조하는 이미지 등록 기술의 한 범주입니다. 여기서는 AxioVision의 구현 방식을 사용하였습니다.

    이 참조 프레임은 이미지 스택에서 임의로 선택합니다.
  2. 이미지 감산을 수행하여 반응 세포를 식별합니다. 이 과정을 자동화하기 위해 ImageJ v1.42 (http://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD)에서 자체 작성한 매크로를 사용합니다. 각 스택에 대해 최소 투영 이미지(minimal projection image)를 생성합니다. 원본 스택에서 최소 투영 이미지를 감산하면 반응 세포가 나타납니다 (그림 4B).
  3. 감산된 스택에서 관심 영역(ROI)을 식별하고 ImageJ의 Multi-Measure 플러그인을 사용하여 ROI 좌표를 얻습니다. 한 실험의 모든 스택을 처리하고 모든 ROI 좌표를 ROI 마스터 리스트에 저장합니다 (그림 4C).
  4. ROI 마스터 리스트와 자체 작성한 매크로 및 ImageJ의 Multi-Measure 플러그인을 사용하여 원본 이미지 스택에서 세포 반응을 측정합니다 (그림 4D). Matlab (Mathworks Inc., Natick, MA)에서 반응 곡선과 히트맵을 작성합니다.

6. 대표 결과

네 마리의 개별 마우스로부터 수집한 소변 샘플을 이용한 VNO 이미징 실험의 예가 그림 5에 제시되어 있습니다. 슬라이스는 다양한 활성화 패턴을 보이며 소변 자극에 반응합니다. 최소 하나 이상의 소변 자극에 반응을 보이는 약 80개의 세포가 식별되었으며, 이들의 반응 ΔF/F 값이 히트맵(그림 5A)에 표시되었습니다. 세포 1, 2, 3의 반응 추적 곡선은 그림 5B에 표시되어 소변 자극에 의한 시간 경과별 활성화를 보여줍니다. 세포 1은 암컷 소변 샘플 모두에 반응하지만 수컷 샘플에는 반응하지 않는 반면, 세포 2는 이와 반대되는 활성화 패턴을 보이며 수컷 샘플 모두에만 반응합니다. 세포 3은 개별 수컷 및 암컷 샘플 모두에 의해 활성화됩니다. 세포 1과 2는 소변 내의 성별 특이적 신호에 대해 특징적인 반응을 보입니다 15.

서골비기관(VNO) 적출, 해부학적 도식, 감각 분석을 위한 장비 설정.
그림 1 VNO 박리 과정의 모식도. A. 마우스 머리 내 VNO의 해부학적 위치. G-CaMP2 마우스의 머리를 해부하여 구개부의 연조직을 제거해 VNO가 드러나도록 뒤집어 놓은 상태이다. 삽입도는 동일한 부위의 형광 이미지이다. VNO의 신경상피가 밝은 녹색으로 나타난다. B. 보메르뼈(vomer bone)에 둘러싸인 격리된 VNO의 측면 모습(위)과 동일한 VNO의 형광 이미지(아래). C. VNO의 관상면 뷰 및 해부 과정. 하나의 VNO를 비중격에서 분리하고, 이후 서골(vomer bone)을 제거하여 신경상피를 추출할 수 있다. D. VNO는 LMA 내에 매립되어 있습니다. E. 포매 블록을 절편 제작을 위한 조직 홀더에 접착합니다. 조직 홀더를 180도 각도로 전진시킵니다.200 μm 절편 제작을 위해 금속 배럴 밖으로 아가로스 블록을 밀어냅니다. 절단 칼날은 금속 배럴에 가깝게 배치합니다. F. VF300 조직 절편기 시스템의 측면도. B.V., 혈관. N.E., 신경상피.

A. 이미징을 위한 광학 조정이 된 현미경 설정; B, C. 생물학적 시료의 현미경 이미지.
그림 2 VNO 절편. A. VNO 절편은 상온의 산소 공급 mACSF 내에서 유지된다. B. VNO 절편의 DIC 이미지. C. G-CaMP2 마우스 VNO의 2-광자 이미지. 스케일 바, 50 μm.

VNO 관류 장치, 시린지 펌프, 그리고 데이터 결과 그래프가 포함된 크로마토그래피 방법 도식.
그림 3 관류 시스템 설정 모식도. A. 입구와 출구가 있는 전형적인 관류 챔버. VNO 슬라이스는 챔버 중앙에 위치하며 조직 앵커로 눌려 있다. VNO 조직이 압박되지 않도록 조직 앵커에서 중간 나사들을 제거한다. B. 관류 챔버를 침수 렌즈(dipping objective) 아래의 현미경 스테이지 위에 배치합니다. mACSF 유입구, 흡입 배출구 및 관류 팁이 표시되어 있습니다. C. 단일 배럴 시린지 펌프를 통해 링거액을 관류 팁으로 지속적으로 주입합니다. D. 자극 샘플의 편리한 로딩 및 주입을 위해 HPLC 인젝션 루프 시스템을 채택하였습니다. E. 로딩 및 주입 위치에서의 흐름 방향을 나타낸 모식도. 링거액, 녹색. 자극 시료, 마젠타색. 화살표는 흐름 방향을 나타냄. F. 관류 시스템의 지연 및 세척 시간 측정. Rhodamine 6G 형광 염료를 샘플 루프에 로딩하고, 화살표로 표시된 5초 시점에 밸브를 주입 위치로 전환한다. 형광 신호의 변화가 10-30초 사이에 검출되며 이후 감소한다.

자극 응답 분석 및 데이터셋 개요를 포함한 현미경 영상의 이미지 등록 및 ROI 처리.
그림 4 이미지 처리 파이프라인. A. 한 슬라이스의 모든 이미지 프레임을 참조 프레임에 맞춰 등록합니다. B. 스택의 최소 투영(minimal projection)을 원본 프레임에서 뺍니다. 뺄셈 후에는 응답 세포들이 뚜렷하게 나타납니다. C. ROI를 선택하고 해당 좌표를 마스터 리스트로 작성합니다. D. 원본 스택에서 ROI 마스터 리스트를 사용하여 응답 세포를 측정합니다.

ΔF/F 분석을 보여주는 히트맵 및 선 그래프; 신경 활동에 대한 FVB, CBA, BL6 데이터 비교
그림 5 대표적인 G-CaMP2 VNO 이미징 실험. A. 개별 수컷 및 암컷 소변으로 자극된 슬라이스의 ΔF/F 응답 히트맵. 소변 샘플은 개별 수컷 및 암컷 마우스로부터 수집되었다. X축은 슬라이스에서 식별된 응답 세포를 나타낸다. Y축은 실험에 사용된 소변 샘플을 나타낸다. 컬러 바는 ΔF/F 값을 나타낸다. B. A에서 표시된 3가지 대표 세포의 응답 시간 경과. 화살표는 자극 적용 시점을 나타낸다. F-FVB, 암컷 FVB; F-CBA, 암컷 CBA; M-FVB, 수컷 FVB; M-BL6, 수컷 C57BL/6.

특정 시약 및 장비 표:

시약 및 기기 명칭 제조사 카탈로그 번호 비고 (선택 사항)
관류 챔버SiskiyouPC-H수평형
슬라이스 고정 장치Warner InstrumentsSHD-22CL 
관류 포트 홀더ALA scientific, Inc.MPIOH-S 
시린지 펌프New Era Pump Systems, Inc.NE-300 
저압 주입 밸브ChromtechV-451 
PEEK 튜빙Chromtech15311/16" OD, 0.25mm ID
PEEK 샘플 루프Chromtech180320 μL
Hamilton 시린지Chromtech80630100 μL

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토론

Dulac과 Axel에 의해 발견된 이후 5, 대다수의 서골비강 수용체(vomeronasal receptors, VRs)는 여전히 오판 수용체(orphan receptors)로 남아 있습니다. 이러한 화학감각 수용체의 페로몬 리간드와 동물의 행동을 매개하는 이들의 역할은 아직 명확히 밝혀지지 않았습니다. 지금까지는 단 한 쌍의 리간드/수용체인 ESP1 펩타이드와 그 인지 수용체인 Vmn2r116 (V2Rp5)만이 확인되었으며, 이들이 특정한 사회적 정보를 전달한다는 것이 입증되었습니다 19,23. 또 다른 수용체인 V1rb2는 암컷 생쥐의 소변에 풍부한 것으로 추정되는 2-heptanone에 반응하는 것으로 나타났습니다 24. 그러나 이 리간드에 의해 전달되는 구체적인 정보는 여전히 불분명합니다. 본 연구에서 개발한 방법은 수많은 자극에 대한 VNO 뉴런의 반응 특성화와 활성화 패턴 분석을 가능하게 합니다. 이 방법을 사용하여, 특정 세포들이 수컷 또는 암컷의 소변에 특...

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공개 사항

선언된 이해상충 없음.

감사의 글

동물 사육 및 기술 서비스에 대해 훌륭한 지원을 제공해 주신 Andrea Moran과 Stowers Institute의 실험동물서비스센터(LASF) 구성원들에게 감사드립니다. 본 연구는 Stowers Institute와 NIH(NIDCD 008003)로부터 CRY가 받은 연구비 지원을 통해 수행되었습니다. 본 콘텐츠의 책임은 전적으로 저자들에게 있으며, 국립청각 및 기타 의사소통 장애 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 반드시 대변하는 것은 아닙니다. tetO-G-CaMP2 마우스에 대해 Stowers Institute, CRY 및 LM의 미국 특허가 출원 중입니다.

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참고문헌

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영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현
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