아세테이트 키나제 활동의 결정을위한 방법을 설명합니다. 이 분석은 다른 phosphoryl acceptors와 아세테이트 - 성형 방향으로 아세테이트 키나제 효소의 활동과 속도론을 결정하기위한 직접적인 반응을 활용합니다. 또한,이 방법은 다른 아세틸 인산 또는 아세틸 - COA 활용한 효소를 시금 활용하실 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
아세테이트 키나제, 아세테이트, 설탕 키나제 - Hsp70 - 굴지 (ASKHA) 효소 superfamily 1-5의 회원은 기판으로 ATP를 이용 아세틸 인산에 아세테이트의 인산화 가역에 대한 책임이 있습니다. 아세테이트 kinases는 Archaea 중 하나 속에서 발견, 박테리아에 유비 쿼터스하고 있으며, 또한 Eukarya 6 미생물에 존재한다. 가장 잘 특징 아세테이트 키나제는 그 메탄 생산 archaeon Methanosarcina thermophila 7-14에서. 단 인산염 - 성형 아세틸 방향으로 ATP하지 i를 PP 활용할 수도 있지만 아세테이트 키나제는 Entamoeba histolytica, 아메바 이질의 원인이되는 대리인으로부터 격리되어 있으며, 지금까지이 속 15,16에서만 발견되었습니다.
아세틸 인산 형성의 방향에서 아세테이트 키나제 활동이 일반적으로 첫번째 Lipmann에 의해 설명 hydroxamate 분석을 사용하여 측정17-20, 효소의 pyruvate의 키나 아제 및 젖산 탈수소 효소 21,22에 의해 ADP로 ATP의 전환이 NAD으로 NADH의 산화에 결합되는 결합 분석 +, 또는 아세틸 인산 제품의 반응 후 무기 인산염의 릴리스를 측정 분석 히드록 실 아민 23. 반대로 활동은 아세테이트 - 형성 방향은 ADP에서 NADP의 감소 + 효소의 hexokinase 및 포도당 6 인산 탈수소 효소에 의해 24 NADPH로하는 ATP 형성을 결합하여 측정됩니다.
여기 커플링 효소를 필요로하지 않는 아세테이트 형성의 방향으로 아세테이트 키나제 활동의 검출하는 방법을 설명하는 대신 아세틸 인산 소비의 직접적인 결정에 따라 달라집니다. 효소 반응 후 남아있는 아세틸 인산이 hydroxamate 분석에 관해서 spectrophotometrically 측정할 수있는 푹 삭은 hydroxamate 복합 변환됩니다. 따라서 일와는 달리ADP에서 ATP의 생산에 의존이이 방향에 대한 andard 결합 분석,이 직접적인 분석은 ATP 또는 PP i를 생산 아세테이트 kinases 사용할 수 있습니다.
프로토콜
이 프로토콜의 전체 구조는 그림 1에 설명되어있다.
1. 표준 곡선 및 Assays을위한 솔루션 준비
- 히드록 실 아민 - HCL의 2 몰 / L 솔루션의 100 ML를 준비합니다. 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드의 13.9 g (MW 69.49 g / 몰)을 무게와 약 50 ML 증류수 - 탈이온수 (ddH 2 O)에 용해. 수산화 칼륨의 알약이나 집중 솔루션을 사용하여 7.0 산도를 조정합니다. 100 ML에 최종 볼륨을 가져와. 솔루션은 최대 30 일 또는 4 ° C 90 일까지에 대한 상온에서 저장할 수 있습니다.
- 산화철 염화 / 염산 용액 100 ML을 준비합니다. 13.5 g 산화철 염화물 (MW 270.32 g / 몰)을 무게와 약 50 ML ddH 2 O.에 용해 41.3 ML 집중 염산 (12.1 몰 / L)을 추가 100 ML의 최종 볼륨 가져와. 산화철 염화의 최종 농도는 0.5 몰 / L와 염산의 최종 농도는 5 몰 될 것입니다/ L. 솔루션은 상온에서 저장됩니다.
- trichoroacetic 산의 1.84 몰 / L 솔루션의 100 ML를 준비합니다. trichloroacetic 산 (MW 163.39 g / 몰)의 30.....
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토론
이 분석에서 아세틸 인산의 감지는 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드의 충분한 농도와 산화철 염화물 용액의 농도와 산도에 의존적일 수 밖에 없습니다. 분석 볼륨의 변경은 이러한 구성 요소 모두의 재검토가 필요합니다. 효소 반응이 여기에 설명된 37 실시했다 ° 5 분 ° C 60 수행한 히드록 실 아민의 종료와 함께 C. 이것은 높은 온도는 아세틸 hydroxamate에 남아있는 아세틸 인산의 급속한 전환 수 있도록 중요합니다. 흡광도의 색상 개발 단계 및 측정에 소요되는 기간은 덜 중요하고, 히드록 실 아민 솔루션뿐만 아니라 다음과 같이 작은 5 분 최대 15 분 이내에 수행할 수 있습니다. 샘플의 산성은 효소의 강수량으로 이어질 수 있으며 탁도보다는 실제 색상의 변화로 인해 부당하게 높은 독서를 만들 수있는 샘플은 흡광도를 읽기 전에 centrifuged해야합니다.개발된 반응의 내역은 10~15분 후에 발생하기 시작합니다.
효소 속도론을 조사이 분석의 주요 합병증은 사용하.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NSF 상을 # 0,920,274 및 사우스 캐롤라이나 실험 역 프로젝트 (SC - 1700340) KSS에 의해 지원되었다. 본 논문은 클렘슨 대학 실험 역 5929 기술 공헌 번호입니다.
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재료
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| 아세틸 인산 | 시그마 알드리치 | 01,409 | 리튬 소금 (97 %) |
| 나트륨 인산염 일염기의 (탈수) | ThermoFisher | S381 | |
| 나트륨 인산염 이염 (무수) | ThermoFisher | S374 | |
| 마그네슘 염화 (hexahydrate) | ThermoFisher | M33 | |
| 트리스베이스 | ThermoFisher | B152 | |
| 산화철 염화물 (hexahydrate) | ThermoFisher | I88 | |
| Trichloroacetic 산 | ThermoFisher | A324 | |
| 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 | ThermoFisher | H330 | |
5' - diphosphate을 아데노신 나트륨 소금 | 시그마 알드리치 | A2754 | |
| Biomate III 분광 | ThermoFisher | 142,982,082 | 표준 UV / VIS 분광 광도계 |
참고문헌
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 7290-7294 (1992).
- Bork, P., Sander, C., Valencia, A.
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