여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.
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방법 논문
아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
같은 쥐 H-1PV 및 MVM 등 설치류의 parvoviruses은 (PV), 작은 icosahedral, 단일 좌초된, DNA 바이러스입니다. 그들의 게놈은 각각 한 비 구조 (NS1과 NS2)과 capsid 단백질 (VP1과 VP2)의 표현을 조절이 발기인 P4와 P38을 포함합니다. 그들은 oncolytic 및 oncosuppressive 능력에 대한 anticancer 대리인의 인간 2 비 병원성하면서로서 높은 관심을 끌. NS1 바이러스는 세포 독성의 3 대 이펙터입니다. 추가로 천연 antineoplastic 활동을 강화하기 위해서는 이러한 벡터로부터 파생은 치료 transgene (예 : 세포 독성 폴리펩티드, 시토킨, 케모카인, 종양 억제 유전자 등) 4 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩 교체에 의해 생성되었습니다. 재조합 parvoviruses (recPVs)는 벡터가 NS1 / 2 코딩 시퀀스 및 바이러스성 DNA의 증폭 및 패키징에 필요한 PV의 게놈 telomeres을 유지합니다. 생산recPVs 단지별로 생산 세포 (일반적으로 HEK293T)에서 발생하는 공동 transfecting 부사장 단백질에 대한 유전자 인코딩 (그림 1) 4을 표현 두 번째 벡터 (pCMV-VP)으로 세포를. 이렇게 생성된 recPV 벡터는 복제에 결함이 있습니다. recPVs 그들이 생성되어있는 부모의 바이러스에 대하여 강화된 oncotoxic 활동을 소유 입증했지만, 그들의 생산을 주요 과제 남아 강력하게 안티 - 암 임상 응용에 이러한 에이전트의 사용을 hampers.
우리가 사용하는 다른 프로토콜에 비해 이상 10 배 이상으로 recPVs의 생산을 향상 HEK293T로 E2a, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자 (예 : pXX6 플라스미드)를 포함하는 광고-5 파생된 벡터의 도입을 발견. 이 연구 결과를 바탕으로, 우리는 recPVs 생산을 강화하는 데 필요한 게놈 adenoviral 요소뿐만 아니라 parvovir 포함되어 AD-VP-헬퍼 소설을 만들었저희 부사장 유전자 단위 5. AD-VP-헬퍼의 사용은, 레크 리에 - 베트남 후 증후군의 생산 ((예 NB324K) 가능 transfect하기 어려운 세포 라인의 활용, 바이러스성 감염 단계 (같은 플라스미드 transfection 반대)에 전적으로 의존 프로토콜을 사용하여 수 그림. 2). 우리는 크게 최종 제품 5 품질에 영향을 미치지 않고, 생산 시간 및 비용을 모두 절감, 생산 재조합 바이러스의 양을 향상 방법을 제시한다. 또한, recPV의 대규모 생산은 (현탁액 세포와 bioreactors에서) 지금 생각할 수있다.
프로토콜
biosafety 레벨 2 연구실은 재조합 parvoviruses (recPV)의 생산을 위해 필요합니다.
프로토콜은 두 가지 부분으로 세분화됩니다. 첫 번째 부분은 (transfection 통해 recPV 생산) 프로토콜의 두 번째 부분 (감염을 통해 recPVs 생산)에 inoculum 역할 recPVs의 최소한의 금액을 생산하는 데 필요합니다. 일단 recPVs의 작은 금액은 프로토콜의 첫 번째 부분을 생략할 수 있고, 생산하고 있으며, 재조합 파르 보 바이러스는 아데노 바이러스 헬퍼를 통해 파르 보 바이러스 capsid 단백질 (아래)에 대한 유전자 인코딩을 제공 감염을 통해 증폭하실 수 있습니다.
1. Transfection 통해 recPVs 생산
1.1 바이러스성 DNA의 transfection
그것도 양이온 lipids 또는 인산 칼슘을 기반 프로토콜의이 섹션에있는 기존의 DNA transfection 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 Fugene H를 사용차원 Transfection 시약. transfection 효율을 제어하려면, 우리는 플라스미드 표현 향상된 녹색 ....
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토론
우리는 recPV 생산은 adenoviral 게놈 요소의 존재에 의해 향상될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 transfection 통해 아데노 바이러스 게놈 요소를 제공함으로써 관련 recPV와 함께 광고 - 부사장 - 도우미와 100 개 이상의 접이식 공동 감염 세포에 의해 10 개 이상의 배 (0.3-5 TU / 셀)에 의해 recPV 수율을 증가 기존의 프로토콜에 비해. 프로토콜은 더욱 아데노 바이러스 게놈 요소의 전달 및 감염에 사용하도록 AD-부사장 도우미의 최적 농도에 가장 적합한 타이밍을 결정함으로써 최적화할 수 있습니다 여기에서 설명한.
큰 transgenes (이상 1600 기지)와 RecPVs은 덜 효율적으로 생산됩니다. 이것은 아마도 transgene을 삽입하여, PV 적절한 바이러스성 DNA의 포장에 필요한 CIS-연기 요소가 제거됩니다 사실 때문입니다. 생산에 영향을주지 않고 PV의 게놈에 삽입하실 수 있습니다 transgene의 최적 크기는 70.......
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공개 사항
우리는 공개 할게 없다.
감사의 글
우리는 특히 마커스 뮐러, 실비아 Münstermann, 바바라 Liebetrau와 맨디 Roscher에서 DKFZ 바이러스 생산과 개발 단위의 팀을 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 교육과 연구 (BMBF)와 Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle 뒤 그랜드 - 예상 응용 Tumour 바이러스학의 공동 프로그램의 프레임 워크의 Helmholtz 협회의 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| DMEM | 시그마 | D5796 | |
| MEM | 시그마 | M4655 | |
| Foetal 소 혈청 | PAA | A15-101 | |
| L-글루타민 | Gibco | 25030-024 | |
| Fugene | 로슈 | 047097050001 | |
| 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) | Invitrogen | 25300062 | |
| Benzonase Nuclease | 시그마 | E8263 | |
| Adeno-X 신속한 Titer 키트 | Clontech | 632,250 |
참고문헌
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183(2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185(2010).
- Hristov, G.
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