방법 논문

방사성 현장에서 하이브리드화

DOI:

10.3791/3764

⸱

2012년 4월 27일

 ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University , 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜이 성공적으로 양적 척추 종의 여러 조직 유형의 수준과 mRNA의 표현의 공간적 패턴을 감지하는 데 사용됩니다. 방법은 낮은 풍요로움의 성적 증명서를 감지하고 동시에 슬라이드 수백 처리 가능합니다. 우리는 예제와 같은 조류 배아 뇌의 형성의 표현 프로파일을 사용하여이 프로토콜을 제시한다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자가 표현되는 타이밍, 레벨, 세포 현지화 및 세포 유형을 안다는 건 유전자의 기능에 대한 우리의 이해에 기여한다. 이러한 기능을 각각의 세포 내에서 mRNAs에 원위치 하이브리드화에서 함께 수행할 수 있습니다. 여기 클레이튼 외. (1988) 1, 특히 성인 척추 두뇌 2-5 위해, 여러 해 동안 우리가 실험실에서 성공적으로 작동되었습니다에서 수정된 원위치 하이브리드화 방법에 방사성을 제시. 대상 시퀀스로 긴 보완 RNA (cRNA) 프로브는 낮은 풍요의 성적 6,7의 검출을 허용합니다. cRNA 프로브로 방사성 세포핵의 설립이 낮은 풍부한 성적 증명서 및 정량 분석​​에 대한 검출 감도를 허용 역시 가벼운 민감한 X 선 필름이나 조직을 통해 코팅 에멀젼에 의해. 이러한 검색 방법은 타겟 유전자 표현의 장기 기록을 제공합니다. 비 방사능 탐사 필로폰과 비교이러한 쫄지마-라벨 등 ODS, 방사성 프로브 하이브 리다이 제이션 방식은 낮은 풍요로움의 성적 증명서를 감지할 수 HRP-항체 및 / 또는 TSA 키트를 사용하여 여러 증폭 단계를 필요로하지 않습니다. 따라서이 방법은 정량 분석​​을위한 신호 강도와 타겟 mRNA 금액 사이의 선형 관계를 제공합니다. 그것은 동시에 100-200 슬라이드를 처리하실 수 있습니다. 그것은 배아의 여러 발달 단계를 위해 잘 작동합니다. 배아 세포가 어려운 조직 섹션에있는 세포 집단 사이의 경계를 확인하고, 세포 사이에 덜 결합으로, 어른 조직보다 더 깨지기 때문에 유전자 발현의 대부분은 발달 연구 부분에 전체 배아 및 비 - 방사성 방법 8,9를 사용합니다. 반대로 감성의 더 큰 범위로 인해 우리의 방사성 접근은 쉽게 인구 사이의 경계를 확인하고, 조직 지역 간의 유전자 발현의 해상도에서 높은 콘트라스트를 얻을 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 연구자가 속한새로 확인된 유전자의 가능한 의미, 그리고 더 관심이 유전자의 기능을 예측했다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 조직 준비

  1. 신선한 조직을 수확. 조류 배아의 경우 신중하게 계란을 열고 1xPBS, 두 번있는 접시에서 배아를 청소하십시오. 성인 두뇌의 경우 신속하게 뇌를 제거하고 부드럽게 1 X PBS로 씻는다.
  2. sectioning 위해 필요에 따라 조직을 orientating, 10 월 조직 테크의 전체 임베디드 곰팡이로 배아 또는 성인 두뇌를 포함하고, 신속하게 블록의 내부에 혼합물을하지 않도록주의되는 에탄올과 드라이 아이스의 혼합에 그것을 배치하여 블록을 동결 .
  3. 10-12 μm의 두께 섹션으로 그라 이오 스탯에 냉동 샘플을 썰어. 두뇌와 태아의 조직은 최고의 절단 온대는 -20 ° C.로 -18 ° C의 범위 내에
  4. 슈퍼 플러스 유리 슬라이드에 고정된 부분을 탑재합니다.
  5. -80 ° C.에서 슬라이드 상자에 섹션을 저장

2. 방사성 Riboprobes의 생성 (해당 기관의 방사선 안전 절차를 사용하십시오)

  1. 정화 선형 DN을 생성중 플라스미드 DNA 또는 RNA의 효소 프로 모터 바인딩 사이트에 연결된 삽입의 PCR에 의한 RNA 중합 효소의 프로 모터 사이트에 둘러싸인 복제된 조각의 효소 제한된 다이제스트에 의한 관심의 cDNA의 템플릿. 그것은 3 '과 5'PCR의 primers의 일부로 RNA 중합 효소의의 발기인으로 PCR 파편을 생성하는 것도 가능합니다. 젤은 GENECLEAN 겔 정화 키트로 제한하거나 PCR 생성된 조각을 정화.
  2. 0.5 ML Eppendorf 튜브하려면 원하는 금액으로 볼륨을 가지고 0.5-1 선형의 DNA 템플릿을 정화의 μg, 전송 버퍼, DTT, RNasin, AGC 염기 혼합 용액 및 RNase 무료로 물을 추가합니다. 그렇다면 안티 센스 또는 감각 riboprobes 중 하나를 만들기 위해 S 35-UTP하고 적절한 RNA의 효소를 추가합니다.
  3. 37 ° C의 물을 욕조에 1 시간을위한 혼합물을 품어. RNA 중합 효소의 또 나누어지는를 추가하고 또 다른 1 시간 동안 알을 품다.
  4. 3M의 아세트산 나트륨 용액 (총 볼륨의 0.1 배) 100 % EtOH를 (2.5 구경이 추가Eppendorf 튜브에 전체 볼륨의 주민 등록증) 합성 RNA의 riboprobe을 침전합니다.
  5. 드라이 아이스 또는 -80 ° C에서 15 분 이상의 이상의 3 시간 동안 침전 도움으로 알을 품다.
  6. 펠렛 RNA 4에서 centrifuging 의한 ° C와 30 분위한 테이블 상단 Eppendorf의 원심 분리기에서 15,000 RPM.
  7. 표면에 뜨는를 제거하고 70 % EtOH로 펠렛을 씻어 잘 펠릿를 섞어 손가락으로 누릅니다.
  8. 다시 펠렛 RNA 4에 centrifuging 의한 ° C ~ 30 분 15,000 RPM.
  9. pipeting에 의해 완전히 뜨는 제거 후 40 μl 하이브 리다이 제이션 솔루션을 추가합니다. 에서 퇴원 pipeting하여 잘 섞는다.
  10. 잘 섬광 유리병, 믹스 3 ML 안전 - 해결 솔루션에 솔루션 1 μl를 넣어하고 신틸레이션 계수기의 카운트를 측정.
  11. 일주일 이내에 사용하기 위해 -20 ° C에서 riboprobe로 Eppendorf를 놓습니다.

3. 조직 트리 트먼트

  1. 후드에서 신선한 PBS는 4 % paraformaldehy 버퍼 준비3-5에 대한 ° C 상온 위 드 솔루션입니다. -80부터 플레이스 슬라이드 ° C 스토리지 드라이 아이스에 메탈 선반에, 후드 아래 공간을 위해 노력하고 운반하고 4 % paraformaldehyde 용액에 선반을 배치하고, 실온에서 5 분 동안 품어.
  2. 15 저러나 각 (딥 당 일초 정도)에 대해 1 X PBS로 3 회 씻는다.
  3. 후드에서 아세틸화 버퍼를 10 초 내에 적극적으로 잡고 흔들어. 즉시 슬라이드 선반을 포함하는 트레이에 기름을 붓고 10 분 동안 품어, riboprobe의 구속력 배경을 줄일 수 있습니다.
  4. 15 저러나에서 2 X SSPE에서 3 번 씻어.
  5. 70 %, 95 %의 각 단계 2 분 100 % EtOH를 직렬로 탈수가 (후드에 있어야 할 필요는 없습니다).
  6. 최소한 10-15 분 동안 후드 아래 슬라이드를 건조합니다.

4. 이종 교잡

  1. riboprobe의 금액 (슬라이드 당 0.5-1x10 6 CPM) 및 모든 슬라이드에 필요한 하이브 리다이 제이션 솔루션 (슬라이드 당 100 μl)를 계산합니다. Prewa65 RM riboprobe - 하이브 리다이 제이션 믹스 ° C에서 5 분 동안 riboprobe을 변성합니다.
  2. riboprobe - 하이브 리다이 제이션 슬라이드 전체 라인 솔루션, 그리고 조직과 coverslip 위에 고르게 확산 유리 coverslip을 사용 중 Pipet 100 μl. 장소는 4 시간의 최소 65 ° C 오일 목욕과 16 시간 최대로 천천히 직립 금속 랙 및 장소 랙에 똑바로 마주 가로 슬라이드. 오일 coverslips 주변 밀폐 씰을 만듭니다.
  3. 오일 목욕에서 금속 선반을 제거하고 티슈로 랙 주변에 여분의 기름을 닦아냅니다.
  4. 커버 슬라이드와 클로로포름, 두 번 들어있는 유리 또는 금속 쟁반에 금속 선반에서 기름을 씻는다. 2 기 클로로포름 세척은 다음 실험의 첫 번째로 사용할 수 있습니다.
  5. 0.1 %의 β-메르 캅 토 에탄올 + 2 X SSPE 솔루션으로 트레이로 덮여 슬라이드와 랙를 전송하고 coverslips를 풀어 제거 초과 하이브리드화 solu를 해산하기 위해 몇 저러나과 아래 위로 이동기.
  6. 0.1 % β-메르 캅 토 에탄올 + 2 X SSPE 신선한 솔루션 적용 슬라이드와 랙를 전송하고 조직 섹션을 긁힘 방지하기 위해 솔루션의 RNase 무료 포셉로 coverslips를 제거합니다. 이 X SSPE의 0.1 % β-메르 캅 토 에탄올의 솔루션, 트레이 가로 슬라이드 선반 홀더에 신선한 랙에되지 않은 슬라이드를 전송합니다.
  7. 신선한 0.1 %가 β-메르 캅 토 에탄올의 슬라이드와 랙 + 2 초과하는 언바운드 RNA 프로브를 제거하는 1 시간을위한 상온에서 X SSPE 솔루션입니다.을 품어 이것과 방사성 폐기물 등 이전 수성 세척 솔루션뿐만 아니라 coverslips를 폐기하십시오.
  8. 65시 prewarmed 2X SSPE 솔루션 ° C로 슬라이드와 랙 전송 0.1 % 농도의 마지막으로 β-메르 캅 토 에탄올을 추가하고 1 시간 동안 65 ° C에서 품어. 방사성 폐기물로 폐기하십시오.
  9. 전송 및 30 분 각 65 prewarmed 0.1 X SPPE에서 슬라이드를 두 번있는 랙 ° C를 품어. 에서 제거 방사능의 양을이 단계는 매우 작고 더 이상이 단계 이후 과도한 방사성 폐기물로 간주 없습니다.
  10. 랙 및 슬라이드 70%의 95 %와 2 분마다 100 % EtOH를 탈수.
  11. 적어도 30 분 동안 후드에 슬라이드를 건조합니다.

5. 방사성 신호의 시각화

  1. 필름 카세트에 건조한 슬라이드를 삽입하고 어두운 방에서, 슬라이드를 통해 X-레이 필름 (코닥 BioMax MR 영상) 배치, 그리고 카세트를 닫습니다. 슬라이드가 X-레이 필름의 유제 면을 직면하고 있는지 확인합니다. 성적표의 예상 풍부에 따라 ~ 1~7일에 대한 슬라이드를 쉽게받을 수 있습니다.
  2. 표준 개발자이자 해결사의 x-선 필름을 개발. 하이브 리다이 제이션 신호는 영화에 대한 검정 (유제에 실버 입자를 노출) (그림 1)과 같이 나타납니다.
    1. (선택 사항) 세포의 해상도를 결정하고 조직에 신호를 보려면, 슬라이드 사진 유제에 담근하고 counterstained해야합니다.당신은 결국 cresyl 보라색으로 counterstain하려는 경우 다음 두 번이나 100 % 100 % 95 %, 95 %, 70 %, 50 % EtOH에 각각 1 분 rehydrate 상온에서 5 분 동안 크실렌에서 잠복기에 의해 부분을 delipidize 그리고 탈이온수 인치 당신 delipidization 필요없는 색소를 착색하지 않을 경우 다음 delipidization 필요가 없습니다. 잘 최소한 2~3시간위한 후드 드라이 슬라이드.
    2. 안전한 빛을 이용하여 암실에서 유리 수영 컨테이너의 길이로 반 슬라이드 (즉, 조직)를 충당하기 위해 충분한 코닥 NTB 유제를 쓸어 담은 후 20-30 분 42 ° C 물 목욕에 녹지. 그런 다음 1시 1분 비율 증류수로 희석. 유제의 수준은 현재 슬라이드가 그것에 담근되는 슬라이드의 모든 부분을 커버한다. 당신 슬라이드 많은 경우, 여분의 유제를 준비 할 수 있습니다.
  4. 42 ° C 물 목욕과 폐쇄 가벼운 꽉 용기에 건조 담궈둔 슬라이드 overnig의 희석 에멀젼 파고 슬라이드어두운 방 안에서, 또는 불이 꺼져있는 2-3시간위한 37 ° C에서 오븐에서 HT.
  5. 서로를 만져 때문에 유물을 작성하지 슬라이드에 신중하다고, desiccators를 포함하는 블랙 박스에 랙과 슬롯으로 슬라이드를 전송합니다. 천천히 정적 유도된 라이트 스파크를 방지하고 다음 알루미늄 호일에 상자를 래핑하는 검은 전기 테이프로 상자의 가장자리를 밀봉합니다. 4에서 박스를 보관 ° C에서 며칠에서 주 (X-레이 필름 1 날부터 신호 유제 하에서 오일과 유사).
  6. 1 시간 동안 상온에 슬라이드 박스를 따뜻하게.
  7. 암실에서 슬라이드로 랙를 제거 (또는 금속 선반에 장소 슬라이드 경우 슬라이드 슬롯으로 상자를 사용) 상자에서 3.5 분, 16 ° C에서 코닥 D-19 개발에 그들을 개발할 수 있습니다.
  8. 1 분 동안 상온에서 수돗물에서 개발된 슬라이드를 씻으십시오.
  9. 6 분마다 19 ° C에서 해결사로 두 번 슬라이드를 품어. 조명은 둘째 해결사 보육 동안에 만들 수 있습니다.
    10. 적어도 30 분 동안 상온에서 물을를 실행에 슬라이드를 씻어과 '서부 유럽 표준시'동안 유리 긁힘 방지하기 위해 면도날로 슬라이드의 뒷면에서 에멀젼을 다쳤어요.
  10. 5 분 대한 수돗물의 0.3 % cresyl 보라색으로 조직을 청바지.
  11. ~ 15 저러나 화사 수돗물에 여분 cresyl 보라색 솔루션을 씻으십시오.
  12. 50 %, 70 %, 95% 95 %, 100 % 및 100 % EtOH : ~ 각 알코올 용액에서 15 저러나에 대한 슬라이드를 탈수.
  13. 두번 상온에서 5 분 동안 크실렌의 슬라이드를 품어.
  14. 접착제 추가 슬라이드를 청소만큼 튼튼한 전에 그것은 며칠이 걸릴 것이다; Permount 슬라이드 매체와 (> 16 시간) 하룻밤 후드에서 커버 슬라이드를 건조와 Coverslip.

6. Darkfield 컬러 이미지를 생성

  1. 물로 그것을 wetting하고 면도날로 부서지는하여 슬라이드의 뒷면 (조직없이 비 coversliped 쪽)에서 필요한, ​​더 깨끗한 초과 에멀젼 경우.
    2. <리> 80 % EtOH 솔루션 슬라이드를 씻어과 파편과 먼지를 제거하기 위해 부드럽게 1-2 번 닦으십시오.
  2. darkfield 또는 brightfield 조명 아래에서 사진을 가져가라. 단계 6.2 및 6.3은 쉽게 해부 현미경 darkfield에서 보는 먼지 입자없이 좋은 이미지를 얻기 위해 3 배 더 반복해야 할 수 있습니다.

7. 대표 결과

1) 슬라이드 또는 2 위에 배치되었다 X-레이 필름) 유제 슬라이드에서 코팅 되었음 : SM을 35 방사성 탐사선과 hybridized 조직 섹션에 원위치 하이브리드화 결과에서 볼 두 가지 방법입니다. 세 번째 접근법은 슬라이드 위에 놓여 phosphorimager 화면을 사용하고 있지만, 우리는이 접근법의 해상도가 만족되지 않았습니다. X 선 필름은 빠른 결과와 하이브리드화의 전반적인 상태의 분석을 제공합니다. X 선 필름 데이터는 또한 광범위한 해부학 해상도를 보여 및 정량 분석​​가 사용할 수 있습니다10. FoxP1 및 CoupTF2 유전자 발현에 대한 안티 센스 탐사선과 hybridized 늦은 조류 배아 헤드의 x-선 필름 이미지의 예 그림 1A와 B에 있습니다. 두 유전자가 특정 뇌 제트 연료의 파이프에 매우 풍부합니다. 좋은 품질의 X-레이 필름 결과는 않나 (모호한되지 않음)와 높은 신호 대 배경 비율이 있어야합니다. 흐린 이미지는 X 선 필름과 hybridized 조직과 유리 슬라이드 사이의 불규칙한 접촉으로 인해 될 수 있습니다.

유제 담궈둔 슬라이드 들어, 에멀젼은 X-레이 필름 플라스틱처럼되고 apposed로 조직에 코팅 라이트 민감한 실버 염분이 포함되어 있습니다. 동안의 개발, S 35 노출 실버 염분이 많은 X-레이 필름처럼, 실버 입자를 금속으로 변환됩니다. 그러나 실버 예금은 현미경으로 관찰하고 질적으로 측정할 수 유전자 발현을 나타내는 세포를 통해 직접 볼 수 있습니다. 메탈릭 실버 입자를 통해 직접 빛을 차단그리고 brightfield보기 아래에 검은 반점으로 나타납니다. cresyl 바이올렛 counterstain는 (그림 3A, 3C, 그리고 그림. 4) 색깔이 보라색 나타납니다. darkfield에서 실버 입자는 측면에서 오는 빛을 반영하고 흰색 점 (그림 1C, 1D, 3B 및 3D)으로 나타납니다. 이러한 상황에서 cresyl 보라색 얼룩 색깔이 빨간색으로 나타납니다. brightfield에서 하이브 리다이 제이션 신호 darkfield에서뿐만 아니라, 하이브리드화 신호가 전체 조직을 통해 하위 배율 아래에서 볼 수있는 반면, 휴대 해상도 높은 배율 아래에서 볼 수 쉽습니다. darkfield보기 우리가 일반적으로 전체적인 유전자 발현 패턴을 표시하는 데 사용하는 방법입니다. 그러나, X-레이 필름에서 얻은 빠른 결과에 대해 상대적, 유제 담궈둔 슬라이드 긴 시간이 걸린다 (몇 주 한)과 배경을 취득에 더 민감합니다.

강한 배경으로 네 가지 일반적인 소스가 있습니다 : 1) 모든 X-레이 필름 이상의 배경은 일반적으로 수행되는개발자 또는 해결사, 또는 부분적으로 노출된 필름의 문제, 유리 슬라이드 2) 배경은 일반적으로 같은 상용 소스 또는 스스로 준비에서 슬라이드의 부적 절한 silination 등의 세척 또는 유리 슬라이드 준비, 문제로 인해 발생이다; 3) 에멀젼 노출과 개발 배경, 하이브리드화 온도가 너무 낮은주의 포스트 하이브 리다이 제이션 세척 단계 부족 하나 때문에 섹션, 하이브 리다이 제이션 솔루션의 품질, 프로브에 오신 것을 영구적으로 상호 링크를 일으키는 세정 요리 paraformaldehyde 오염에 관한 4) 배경 비 특별히 조직에 S의 디 - 황화물 채권에 35-RNA 프로브를 연결하는 크로스 결과 비활성 DTT 또는 β-메르 캅 토 에탄올이 조직을 레이블링 및 아세틸화을 위해 너무 오래 기다리는 작은 분자로 이어지는 조직, riboprobe 저하됩니다. 그것은 아세트산 무수물 및 triethanolamine을 믹싱의 초 이내에 아세틸화 솔루션에서 슬라이드를 가지고하는 것이 중요합니다. 몇 분 withou를 통과하는 경우이외 특별히 RNA에 바인딩 나서겠다, 슬라이드에 솔루션을 추가 후 아세틸 그룹을 효과적으로 제거되지 않으며. 다른 요소는 신호의 너무 강한 생성할 년 5 월 20 시간 이상의 하이브리드화, 그리고 조직에 대한 방사성 명소 결과, 수성 세차장 중에 슬라이드에 하이브 리다이 제이션 솔루션을 격리 슬라이드의 과잉 기름 방울을 포함하고, 어두운 배경 신호를주는 슬라이드. 여러 슬라이드 (100 개 이상 조각)와 협력하는 경우 제 3 클로로포름은 씻어 또는 변경 클로로포름 세차장을 슬라이드에 남아있는 과잉의 오일 입자를 방지하기 위해 추가합니다. 부주의 조직 치료 즉, 신속하게 충분한 오해 (절개 후 5-10 분 이내) 또는 해동 후 다시 냉동도 저하 mRNA 때문에 배경을 증가 없습니다. 이상의 노출에 대한 배경을 오해하지 않도록주의하십시오.

그것이 매우 민감한 빛이며 어둠 속에서 긴 노출을 필요로하기 때문에 담궈둔 슬라이드에서 유제 배경이 가능합니다. 컴 월 배경 문제는 개발자와 해결사에 대한 온도의 높은도 포함됩니다. 온도, C ° 19 이상의 주변 또는 실내 온도보다 따뜻한 경우, 더 실버 곡물 배경이 얻어진다. 암실로 누출되는 빛의 낮은 수준에 노출 유제 배경을 일으킬 것입니다. (물을를 실행에 최소 30 분) 충분히 해결사를 세척하지, 그때 유제에 걸쳐 갈색 침전물을 생성하기 위해 cresyl 보라색으로 반응 해결사가 없게됩니다. 슬라이드가 cresyl 바이올렛 염색법 전에 고정 후 90 분보다 더 오래 물에 씻은 경우 그러나,이 에멀젼은 자유롭게하고 저조한 얼룩 부분이 될 발생할 수 있습니다. 30 분 세척 후, 고정 및 세탁 후 30-90 분 창 내에서 슬라이드를 착색하기위한 충분한 시간이 없다면, 하룻밤 사이에 슬라이드를 건조하고 그 다음날 더럽히는 것 cresyl 보라색으로 진행합니다. 배경 신호가 더 균일이지만 일반적으로, 대부분의 mRNAs는 특정 유전자 발현 패턴이 있습니다.

e_content "> 다소곳이 조직은 어두운 신호 지역으로 이어지는, x-선 필름에서 유전자 발현 결과에 대해 오해를 불러일으킬 수있다. 조직은 접혀있다면 brightfield 아래 darkfield 또는 cresyl 보라색 얼룩진 부분 아래에 비 묻은 부분을 검사 확인하려면. Cresyl 바이올렛 counterstaining는 조직 상태를 검사하기위한 좋은 방법을 제공합니다.

프로브 특이성의 더 나은 해석을 보려면, 컨트롤 감각 프로브는 여러 인접 섹션에 적용되어야합니다. 대부분의 감각 프로브는 신호를 표시하지 않지만 일부, 그리고 그들이 그렇게되면, 우리는 종종 안티 센스 신호보다 다른 것을 발견했습니다. 우리는 이것이 합성이나 게놈의 안티 센스 가닥에서 다른 유전자를 안티 센스 관련이있을 수도 있다고 생각합니다. 우리는 예를에게 Pax6 감각과 안티 센스 프로브 (그림 2A와 B)을 제시. 안티 센스 가닥이 예상대로 forebrain, 소뇌와 눈 (그림 2A)의 심실 영역에 따라 레이블링 드러내지만, 감각 라를 보여망막의 색소 층 (그림 2B)에 beling.

프로브 크기 위해서는 300-5000 bps의 범위에서 어디 cDNA 프로브를 사용합니다. 프로브 이하 300 bps 작동하지만 신호는 보통 약한입니다. 우리는 5,000 bps보다 더 큰 프로브를 시도하지 않았습니다. 그것은 가능하면 동일한 종류의 조직에 프로브를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 그렇지 않다면, 우리는 다른 종의 섹션에서 프로브를 교차 잡종과 하이브 리다이 제이션을 감소하며 3-5로 알려진 경우, 시퀀스 정체성을 바탕 ° C 단위로 온도를 씻는다. 알려져 있지 않으면, 우리는 시행 착오 하이브 리다이 제이션을 수행하고 온도를 씻는다. 온도가 너무 낮아 경우, cDNA 탐침, 종족 전체 또는 동일한 수종 11 유사 시퀀스의 다른 mRNAs와 교차 잡종 수 있습니다. 실제로, 우리는 조직의 mRNA 대상, 엄격한 하이브리드화 및 세차 온도 (65 ° C) 조건에 ~ 95% 동일하거나 큰 cDNAs 잘 작동 찾으십시오. 울렸다에 시퀀스를 위해~ 동일 85-94%, 하이브리드화 및 세척 온도 초밖에 60 ° C.에 ~ 50의 범위에서 줄일 필요가 있습니다

단계의 대부분의 금속 선반을 사용하는 이유는 클로로포름 세차장과 크실렌의 사용이다. 두 생명체는 플라스틱의 여러 종류의 용융. 유리와 플라스틱의 일부 종류는 다음과 유기물에 강한 있습니다. 그러나 유리 깨고 쉽게하고, 처음에는 저항이라는 일부 플라스틱은 유기물에 노출 오랜 기간 동안 용융 것입니다.

figure-protocol-1
그림 1. X 선 필름과 감광 유제 담궈둔 슬라이드에서 원위치 하이브리드화 이미지 Autoradiography. (AB) X 선 필름 해부 현미경 brightfield 조명과 촬영 () FoxP1 또는 (b) CoupTF2에 안티 센스 riboprobes로 hybridized 배아 일 10시 얼룩말 핀치 가수의 화살 전체 헤드 부분의 이미지. mRNA 표현을 보여주는 영화에서 블랙, 노출 곡물이온. 스케일 막대 = 500 μm의. (CD) 에멀젼은 (C) FoxP1 및 (D) 해부 현미경 하에서 darkfield 조명과 함께 찍은 CoupTF2.에 안티 센스 riboprobes로 hybridized, 포스트 해치 일 6시 얼룩말 핀치의 화살 전체 헤드 부분의 슬라이드 이미지를 움직 였어 화이트, mRNA 표현을 보여주는 조직 위 유제에 실버 입자를 노출. 레드, 바이올렛 cresyl는 얼룩. 스케일 막대 = 200 μm의. 모든 사진은 부리 왼쪽 주동이의입니다. x-선 필름 이미지는 3 일 동안 언젠가 담궈둔 슬라이드에 노출되었다. FoxP1 프로브는 mRNA의 1544-1711 BP 부분에 178 bps이며 CoupTF2는 mRNA의 1-545 BP 부분에 545 bps입니다. forebrain FoxP1의 mRNA가 CoupTF2가 nidopallium (N), arcopallium ()에 풍부하게되는 반면, mesopallium (M), striatum (세인트)와 지느러미 시상 (DT)에 풍부하게, 그리고 더 많은 복부 시상된다 내에서 볼 수 있듯이 . 노출 유형 (그리고 세) 사이에 표현의 일관성이있다. 담궈둔 슬라이드로하지만, 높은 해상도의 라벨은이 보인다D 조직 경계와 제트 연료의 파이프가 직접 식별됩니다. 이것과 종이에 표시된 다른 모든 이미지는 표준 65 ° C 높은 엄중에 하이브 리다이 제이션을 사용하는 부분에서입니다.

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그림 2. 안티 센스 및 다른 패턴을 보여주는 감각적인 라벨의 비교. () Pax6의 안티 센스 가닥은 뇌, 특히 심실 영역 (흰색 화살표)로 표현되었다. 배아 하루에 12에서 얼룩말 핀치에서 가져온 화살 전체 머리 조각의 x-선 필름에 autoradiography가 표시됩니다. (B) Pax6의 감각 스트랜드와 hybridized 인접 섹션은 배경 배아 헤드에 걸쳐 표현하지만, 안티 센스 스트랜드와 같은 망막의 색소 층 (검은색 화살표)의 명백한 표현이 없었습니다. 점선은 전체 두뇌의 윤곽을 나타냅니다. C : 소뇌.

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룽> 그림 3. brightfield과 darkfield 전망하에 늦은 배아 단계 동안 얼룩말 핀치 두뇌에서 가져온 유제 담궈둔 슬라이드에서 유전자 발현의 현장 신호합니다. 유제로 정상 노출에서 배아 일 10시 D1B 표현의 () Brightfield 이미지입니다. 레이블 (블랙) 이렇게 간신히 배율에서 볼 수있다. 프로브는 mRNA의 1-625 BP 부분에 625 bps입니다. (B) (A) 그러나에서와 동일한 섹션 및 배율은 darkfield의 ​​striatum에서 레이블을 보여주는 뷰 (흰색) (세인트)와 시상 (TH)로 전환. 유제에 이상 노출의 배아 당일 12시 Slit3 표현의 (C) Brightfield 이미지입니다. 라벨은 (검은색)을 쉽게 볼 수있다. 프로브는 mRNA의 1243년에서 2021년까지 부분에 779 bps입니다. (B) (A)에서와 동일한 섹션 및 배율은 brightfield 이미지를 일치 척수 (SC)에 darkfield 전망을 보여주는 라벨 (흰색)으로 전환. 주동이의는 왼쪽 방향입니다. CB : 소뇌.

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그림 4. 세포 수준에서 실버 입자 해상도. 표시된 그림 1A와 1C의 낮은 전력 이미지에 비해 다른 뇌 영역과 연령의 세포 위에 은색 알갱이 (검은 반점) (cresyl 보라색)와 얼룩말 핀치 forebrain의 FoxP1 mRNA 레이블입니다. 성인 얼룩말 핀치 mesopallium에서 개별 세포 이상 () 고등 풍부한 표현 (검은색 화살표). 동일한 섹션의 인접 nidopallium의 개별 셀 (블랙 화살촉) 이상 (B) 낮은 풍부한 표현. 배아 하루에 12 mesopallium의 세포 이상 (C) 높은 FoxP1 mRNA 발현 (검은색 화살표). 동일한 섹션의 인접 nidopallium의 세포 이상 (D) 낮은 풍부한 표현 (블랙 화살촉). 예 전지는 노란색 라인으로 돌고있다. 배아 세포 (C와 D) 작은 더 단단히 성인 세포 (A와 B)에 비해 포장. 세포와 유제 사이 공간, 노출 침묵의 분야가 있기 때문에S 35 프로브에서 lver 입자는 세포 기관의 면적보다 약간 큽니다. 스케일 막대 = 10 μm의.

토론

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mRNA의 표현의 원위치 하이브리드화의 방사성 널리 지방 조직 조직, 세포 유형과 뇌의 기능적 활동 2-5,10,12-14 공부를 포함하여 여러 용도에 사용됩니다. 나중에 사용할 누구의 mRNA 표현 뇌의 신경 활동이 증가, 종종 불리는 활동 종속적인 유전자 또는 즉각 조기 유전자에 따라 좌우 유전자에 있습니다. hatchlings / neonates, 청소년을 포함한 여러 연령대, 여러 조직에서, 뇌, 피부 및 근육을 포함하여, 이러한 용도로, 우리의 방법은 포유류 (예 : 인간), 생선 및 양서류, 조류를 포함한 여러 종류에 걸쳐 적용되었습니다 , 성인, 그리고 이곳 전체 배아 부분에 2,3,5,15-17. 우리의 프로토콜의 특징은 다음과 같습니다 : (1) 그것은 해부 학적 특이성과 양적 특이성 사이의 균형을 생산하고 있습니다. x-선 필름에서 유전자 발현을 계량하기 위해, 우리는 이미지의 디지털 사진 (. 예 : 그림 1A 및 1B)를 받아, 검사하고 사진에게 사용관심 지역에서 픽셀 밀도를 측정하고 조직 외부 필름에 배경 수준을 빼야하지만 여전히 유리 슬라이드 2,4에서하는 toshop (어도비) 히스토그램 기능. 세포 수준에서 표현을 계량하기 위해, 우리는 높은 배율 (; 그림 4 40-100X)에서 세포를 통해 실버 곡물의 이미지 가져가라. 우리는 다음 유리 슬라이드에 세포가없이 유사한 영역에서 배경 카운트를 뺍니다, 이미지에 은색 알갱이의 수를 계산하기 위해 NIH에서 웨인 Rasband하여 이미지 J의 문턱 및 측정 기능을 이용, 세포의 숫자로 나누면 셀 당 표현. 4,18의 값 (2) 그것은 동시에 100-200 슬라이드 처리를 허용, 미네랄 오일 목욕 만든 긴밀한 coverslip 인감으로 인해 상대적으로 높은 처리량이 될 수 있습니다. 구하는 표준의 원위치 하이브리드화 방법 parafilm, 매니큐어, 그리고 슬라이드는 공간을 많이 차지 다른 방법과 슬라이드를 봉인하는 데 오래 걸립니다 (3) 그것은 아주이다Dextran 황산과 하이브리드화 버퍼 2,13의 Denhardt의 솔루션으로 인해 낮은 풍요의 성적에 대한 민감한 (4) darkfield의 이미징 접근법은 4,5 해부 현미경에 darkfield 조명 아래에서 사진을 찍고으로 인해 높은 명암 이미지를 얻을. 또한,이 같은 활동에 의존 유전자 발현에서와 같이 유전자 발현의 작은 변화의 민감한 검출 19 특정 행동의 인식 및 생산 기간 동안 활성화된 특정 뇌 영역을 식별할 수 있습니다. 비 방사성 프로토콜에 상대적으로 제한 후자는 세포 해상도와 세포 내에서 mRNA의 위치에 명확하다고하며, 유제와 협력하는 것은 조작과 빛을 매우 민감합니다. 이 같은 조직 10,17,20에서 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현에 레이블을 위해 현장 하이브리드화 이러한 비 방사성 등 다른 방식으로 우리의 방법을 결합하는 것이 가능합니다. 그것은 immunocytochemistry와 조합하여 사용할 수 있습니다위해서는 동일한 시료에 RNA와 단백질 표현 모두에 레이블을 특정 세포 유형 10와 mRNA가 공동 집중하다. 이러한 이중 라벨 실험에 필요한 프로토콜 수정은 인용된 참고 문헌에 설명되어 있습니다.

요약하면, 우리의 접근 방법은 지역 조직, 조직 기능적 활동 및 유전자 기능을 이해하기 위해 타이밍과 유전자 발현의 세포 위치의 이해를 용이하게합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 공개 할게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 수년 동안 프로토콜을 향상 모든 자비스 실험실 구성원을 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 댓글
아세트산 무수물 VWR MK242002
클로로포름 VWR BDH1109
Cresyl 보라색 아세트산 시그마 C5042
그라 이오 스탯 써모 과학 Microm HM550
Deionized 포름 아미드 시그마 F9037
DTT Promega P1171 100mM
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 시그마 ED
금형을 포함 VWR 15160-215
피셔 브랜드 Superfrost 플러스 슬라이드 피셔 과학 22-034-979
포름 알데히드 VWR BDH0506-4LP
포름 아미드 시그마 F7508
GENECLEAN 키트 Q-바이오 유전자 1001-200
코닥 BioMax MR 필름 시그마 Z350370
코닥 NTB 에멀젼 Carestream 건강 8,895,666
코닥 프로 페셔널 개발자 D19 코닥 1,462,593
코닥 전문 해결사 코닥 1,971,746
β-메르 캅 토 에탄올 Calbiochem 444,203
미네랄 오일 VWR IC15169491
NaOH VWR SX0600-1
Paraformaldehyde 시그마 76,240
폴리 Invitrogen POLYA.GF
rATP Promega P1132 10mM
rCTP Promega P1142 10mM
rGTP Promega P1152 10mM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S 35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
안전 해결 솔루션 안전 연구 제품 국제 해결 111,177
아세트산 나트륨 시그마 S7899 3M
나트륨 인산염 이염 시그마 S3264
나트륨 인산염 일염기의 시그마 S3139
SP6RNA 중합 효소의 Promega P1085
금속 선반을 염색법 전자 현미경 과학 70312-54
T7 RNA 중합 효소의 Promega P2075
조직 - 테크 10월 사쿠라 4583
5 배 전사 버퍼 Promega P1181
Triethanolamine VWR IC15216391
트리스-HCL (1 M, 산도 8.0) VWR 101449-446
tRNA 로슈 10109509001

솔루션 :

  1. riboprobes로 만들기위한 시약 : 1.5 μl의 DNA 템플릿 (0.2-0.3 μg / μl), 5 배 최적화된 전송 버퍼의 2 μl, 100mM DTT 1 μl (Promega에서 중합 효소와 함께 제공, 믹스잘 상온에서), RNasin의 0.3 μl (40 대 / μl), AGC ribonucleotide 믹스 솔루션, S 35 UTP 3.5 μl, 1 μl RNA 중합 효소의 1.5 μl. nuclease없는 물을 갖춘 10 μl까지 와요.
  2. AGC의 ribonucleotide 믹스 솔루션 : 10mM ATP, GTP와 함께 CTP의 동일한 금액을 섞는다.
  3. 40 μl RNase와 DNase 무료 물, 3M의 아세트산 나트륨 및 100 % EtOH 125 μl의 5 μl : 무료 S 35 UTP를 제거하는 EtOH 침전에 대한 아세트산 나트륨 용액.
  4. 하이브리드화 버퍼 (10ml 주식) : 100 % deionized 포름 아미드, 5M NaCl 600 μl, 1M 트리스-HCL (산도가 = 8.0)의 5 ML, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 240 μl (산도 = 8.0), 100x Denhart의 솔루션 100 μl, 1M DTT, 20mg/ml tRNA, 20 밀리그램 / ML 폴리 125 μl, 그리고 나트륨 Dextran 황산의 1g 250 μl의 100 μl. 10 ML에 대한 전체 볼륨을 가지고 DEPC-처리된 물을 추가합니다. 모든 나트륨 dextran 황산이 녹아 때까지 55 ° C에서 부화 후 적극적으로 흔들. 에 하이브리드화 버퍼를 저장~ 6 개월 좋다 -20 ° C,.
  5. 4 % paraformaldehyde 용액을 버퍼 : paraformaldehyde를 위해 지정, 50 ~ 열이 ° C 따뜻한 접시에 감동하면서 플라스크에 760 ML 증류수에 paraformaldehyde 40 G를 추가합니다. paraformaldehyde를 해산하기 위해 10N NaOH 320 μl를 추가합니다. (~ 10 분) 용해 후, 10X PBS 100 ML을 추가하고 1리터 때까지 증류수로 볼륨을 제기하셨습니다. 저어과 paraformaldehyde가 해소되기 전까지 솔루션을 가열. 산도는 7.4이어야합니다.
  6. 아세틸화 버퍼 : triethanolamine의 13.6 ML 플러스 증류수 1 리터에 아세트산 무수물의 2.52 ML.
  7. 20x SSPE 솔루션 : 3M NaCl, 200 MM 아뇨 2 PO 4-H 2 O 및 증류수 200 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). 10N NaOH로 pH를 7.4에 대한 해결 방법을 조정합니다.
  8. 10X PBS 버퍼 : NaCl의 80g, KCl의 2.0g, 나 2 HPO 4 14.4g과 KH 2 2.4g 증류수에 PO 4. 산도 7.0에 대한 솔루션을 조정하고 1 라이트로 전체 볼륨을 가지고R.
  9. 두번째 세차 솔루션 : 0.1 % β-메르 캅 토 에탄올과 2X SSPE에서 50 %의 포름 아미드
  10. Cresyl 바이올렛 아세트산 용액 : 수돗물의 3% cresyl 보라색 아세트산 (증류수 좋은 염색법을 방지), 실온에서 플라스크에 감동과 함께 하룻밤 해산. 1mm 워트 먼지 필터 종이와 Buchner 퍼널을 통해 진공 흡입으로 필터링합니다.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363(2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768(2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

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