프로토콜은 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 대기 시간과 재활 성화를 단순 공부하는 효율적이고 재현성 모델 시스템을 설명합니다. 분석은 동질적인 교감 신경 세포 배양을 고용하고 RNA 간섭 및 재조합 단백질의 표현을 포함한 다양한 도구를 사용하여 바이러스 신경 세포 상호 작용의 분자 해부을 허용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
헤르페스는 타입 1 (HSV-1)은 말초 신경의 평생 잠재 감염을 수립 바이러스를 단순. 이것은 잠재 저장조는 전송을 보장하고 임상 질환에 기여하는 반복 재가입 이벤트의 소스입니다. 현재 antivirals는 잠재 저수지에 영향을주지 않으며 아무 백신은 없습니다. lytic 복제 분자 세부 사항이 잘 특성화 있지만, 뉴런에 지연 시간을 조절하는 메커니즘은 애매 남아있다. 대기 시간 우리의 현재 이해 바이러스성 유전자 요구 사항 및 면역 반응의 역할을 정의를 위해 불가 결한되어 작은 동물 모델을 이용한 생체내 연구에서에서 파생됩니다. 그러나, 그것은 살아있는 동물의 면역 또는 이외의 연결을 지원하는 세포에 의해 매개 감염의 더 일반적인 결과로부터 바이러스 신경 세포의 관계에 대한 구체적인 효과를 구별하는 것은 불가능합니다. 또한, 동물 실험은 호스트를 조작 위해 비용이 많이 드는 시간 소모와 사용 가능한 옵션 면에서 제한처리합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 신경 세포 전용 시스템은 필사적으로 지연 및 재가입의 생체내 특성에를 재현하지만, 균질성 및 접근성 측면에서 조직 문화의 혜택을 제공하는 필요합니다.
여기에 맞는 HSV-1 지연과 재활 성화를 공부 쥐 우수한 경추 신경 (SCG) (그림 1)에서 교양 기본 공감 뉴런을 이용한 체외 모델을 제시 대부분의 모든 원하는 조건의 경우. 이외의 연결을 세포를 제거하면 거의 균질 TrkA + 신경 세포 배양은 lytic 복제를 억제하는 아시 클로 비어의 존재 (ACV)에서 HSV-1에 감염됩니다. 아래 ACV 제거, 신실 대기의 인정 특징이 효율적으로 설립되어 전시 비생산적인 HSV-1 감염. 특히, lytic mRNAs, 단백질 및 전염성 바이러스도 선택의 부재에서 감지되고 있지만, 지연 - 관련 증명서 (LAT) 특급이온 핵의 연결에 지속. 바이러스성 genomes은 신경 세포 당 25의 평균 사본 번호로 유지하고 생산 PI3 - 키나 아제 / Akt 신호 또는 신경 성장 인자 1의 간단한 인출을 방해하여 복제에 시달릴 수 있습니다. 바이러스성 lytic 단백질 Us11로 융합된 재조합 HSV-1 인코딩 EGFP는 쉽게 계량되어 재가입으로 인한 복제 기능, 실시간 마커를 제공합니다. 화학 요법과 더불어, 그러한 lentiviral 벡터를 통해 RNA 간섭이나 유전자 전달과 같은 유전적인 방법론이 성공적으로 매우 어려운이 아니라면 불가능한, 동물에있는 기계론의 연구를 허용하는 시스템에 적용할 수 있습니다. 요약에서는 SCG 기반 HSV-1 대기 / 재가입 시스템은 뉴런의 HSV1 지연 및 재활 성화, 누구의 솔루션을 새로운 치료법을 개발에 신선한 통찰력을 제공할 수 있습니다 바이러스학의 오랜 퍼즐을 제어하는 분자 메커니즘을 해명하기위한 강력하고 필요한 도구를 제공합니다 대상 t그는 herpesvirus 탱크를 잠재.
프로토콜
1. 쥐 태아에서 SCG 뉴런의 분리 및 문화
이 프로토콜을 이해하는 데 유용한 컨텍스트를 제공하고,하기 이전 문학의 광범위한 토론을위한 그 체외 배양, 플레이트 코팅 기판, 그리고 혈청 프리 미디어의 구성 요소에 SCG의 기초를 포함하여 SCG 신경 세포 문화의 설립 방법, 독자는 참고 문헌 2-4라고합니다.
- SCG 뉴런에 대한 소스로 쥐의 사용 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 활성 프로토콜 하에서 NIH 지침에 따라 실시되었다.
- 절개를 시작하기 전에 콜라겐과 코팅 laminin 96 잘 조직 문화 요리를 준비합니다. 다중 채널 pipetting 장치를 사용하여 0.66 MG / ML의 쥐의 꼬리 콜라겐을 포함하는 솔루션으로 모두 96 우물을 채울. 즉시 회수 및 최대 8 절개로 사용할 수 있습니다 콜라겐을 제거합니다. T를 제거 후그는 콜라겐, 그건 층류 후드 아래 우물 건조하게하는 것이 매우 중요합니다. 그것이 건조하는 데 걸리는 시간의 양은 접시에 우물의 수에 따라 달라집니다. 예를 들어, 일반적으로 약 5-10 분 소요됩니다. 마르도록 96도 접시에있는 우물을위한지만 30까지 소요될 수 - 40 분 더 큰 포맷으로 24도....
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토론
이 예비 신경 세포 문화 및 감염 시스템은 HSV-1 지연과 재활 성화를 밑에있는 분자 메커니즘을 탐구하기위한 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다. 시스템은 충실히 recapitulates 인간 감염 모두에서, 라이브 - 동물 모델에서 정의된 대기 시간의 인정된 특징을. 바이러스가 SCG 문화에 숨어있는 경우, 전염성 입자와 바이러스 lytic 유전자 제품은 감지되지 않습니다. latently에 감염된 뉴런에서 검색된 유일한 바이러스성 유전자 산물이 핵 내에 축적 비 코딩 LAT 성적 증명서입니다. 재가입 바이러스는 lytic 유전자의 표현과 일치하며 전염성 입자의 생산에 culminates. 또한,이 일차 신경 세포의 세포 배양 모델은 효과적으로 lytic 바이러스 복제를 유도 TSA 등 허용 재활 성화 inducers에 반응입니다.
다른 화학 inducers는 다양한 extents에 재가입을 자극하고 특성과 속도론. 예를 들어, TSA는 re.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는이 원고를 개선하는 데 도움이 그들의 사려깊은 제안 리뷰어 감사드립니다. 이 작품은 NIH에서 MVC (NS21072, HD23315) ACW (GM61139, S10RR017970)와 메신저 (AI073898, GM056927)에 교부금에 의해 지원되었다. MK는 NIH 연수 보조금 (5T32 AI007180)에 의해 부분적으로 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | 회사 | # 카탈로그 | 댓글 |
| 70μm 나일론 필터 (세포 스트레이너) | BD Biosciences | 352,350 | |
| 1X 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS - / -) | Invitrogen | 14,175 | W / O CaCl 2, MgCl 2 |
| 1X 최소 필수 미디어 (MEM) | Invitrogen | 11095-080 | |
| 5 - 플루오로-2'-deoxyuridine | 시그마 | F0503 | -20 ° C에 상점; 1X MEM에서 20 밀리미터 재고를 준비 |
| 96 - 웰 평판 잘 하단 TC 플레이트 | 코닝 | 3599 | |
| 아시 클로 비어 | 를 Calbiochem | 114,798 | -20 ° C에 상점, DMSO 31 밀리미터 재고를 준비 |
| Aphidicolin | Calbiochem | 178,273 | -20 ° C에 상점, DMSO 10 밀리미터 재고를 준비 |
| B-27 보충 | Invitrogen | 17504-44 | |
| Collagenase | 시그마 | C2674 | -20 ° C에 상점; - / - HBSS 10 MG / ML 주식을 준비 |
| D-(+)-포도당 | 시그마 | G6152 | H 2 O에서 40 %의 주식을 준비, 필터는 4 시에 소독 및 저장 ° C |
| L-글루타민 | Invitrogen | 25030-081 | |
| Laminin | 시그마 | L2020 | 급속 냉동 20 μl, H 2O에 1 MG / ML 주식을 준비-80시 aliquats & 매장 ° C ~; 묽은 ~ 2 μg / ML 작업 conc. 멸균 H 2 O의 |
| Leibovit'z L-15 미디어 | Invitrogen | 11,415 | |
| 신경 성장 인자 | 할란 연구소 | BT.5017 | / - - HBSS에서 50 μg / ML 주식을 준비, -80 ° C에 저장 |
| Neurobasal 매체 | Invitrogen | 12,348 | |
| Phosphonoacetic 산 (PAA) | 시그마 | P6909 | -20 ° C에 상점, H 2 O, 75 MG / ML 주식을 준비 |
| 폴리-D-라이신 브롬화 수 소산 | 시그마 | P0899 | -20 ° C에 상점, H 2 O, 20 MG / ML 주식을 준비 |
| 둥둥 꼬리 콜라겐 | Millipore | 08-115 | 농도는 공급 많이 따라 다릅니다, 4시 점포 ° C와 묽은으로 0.66 밀리그램 / ML 작업 conc. 멸균 H 2 O의 |
| Trichostatin | 시그마 | T8552 | -20 ° C에 상점, DMSO 1 밀리미터 재고를 준비 |
| 트립신 2.5 % | Invitrogen | 15090-04 |
참고문헌
- Camarena, V., Kobayashi, M., Kim, J. Y., Roehm, P., Perez, R., Gardner, J., Wilson, A. C., Mohr, I., Chao, M. V. Nature and duration of growth factor signaling through receptor tyrosine kinases regulates HSV-1 latency in neurons. Cell Host & Microbe. 8, 320-330 (2010).
- Johnson, M. I. Primary cultures of sympathetic ganglia.
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재인쇄 및 허가
