방법 논문

도입 단백 분해 효소와 산 촉매 라벨링 워크 플로

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/3891

⸱

2013년 2월 20일

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

이 논문에서

요약

채용 안정 동위 원소 라벨 작업 흐름 18 O 강화 물 (LEO-워크 플로)는 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 다양한 도구입니다. (PALeO) 단백 분해 효소를 이용한 워크 플로우에서, 18 O-원자는 프로테아제에 의해 중재 proteolytic 절단 및 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 소개되어 있습니다. 산 - 촉매 (ALeO) 워크 플로우에서, 18 O-원자는 낮은 산도의 카르 복실 산소 교환에 의해 소개되어 있습니다.

초록

안정 동위 원소는 생물 질량 분광법에 필수적인 도구입니다. 역사적으로, 18 O-안정 동위 원소는 광범위 1-3 proteolytic 효소의 촉매 메커니즘을 연구하는 데 사용되었습니다. 대량 분석법 기반의 단백질 체학의 출현, 안정적 isotopically 풍부한 물 18 O-원자의 효소 - 촉매 결합은 양적 단백질 표현 수준을 (Fenselau 야오 4, 미야기와 라오 5 너희의 검토를 비교하는 인기있는 방법이되었다 외. 6). 18 O-라벨은 화학에 간단하고 저렴한 비용으로 대체 (예 : iTRAQ, ICAT)과 대사 (예 : SILAC) 분류 기술 7 간주됩니다. 활용 단백 분해 효소에 따라 18 O-라벨은 절단 제품 (3)의 C-터미널 카르 복실 그룹에 두 개의 18 O-원자까지의 설립 될 수 8로 세분화 할 수 있습니다. 우리의 PALeO (P rotease-18 O-강화 물을 mploying ssisted 난 abeling 전자) 효소 18 O-라벨의 적응, 우리는 독특한 동위 원소의 서명을 얻을을 50 % 18 O-농축 물을 활용. 고해상도와 함께 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 이온화이 시간은 - 비행의 탠덤 질량 분석법 (MALDI-TOF/TOF MS / MS), 특성 동위 원소의 봉투 특이성의 높은 수준의 절단 제품을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이전에 proteolytic 반응 할 10-11을 감지하고 특성화 내생 프로테아제를 9 모니터링 할 수 PALeO-방법론을 사용했습니다. PALeO는 proteolytic 절단 반응의 매우 본질을 인코딩 때문에, 실험 설정은 간단하고 생화학 enri입니다절단 제품의 chment 단계를 피할 수 있습니다. PALeO 방식을 쉽게 proteolytic 절단 반응의 역학 및 생리 조건을 나타내는 복잡한 생물 표본의 proteolysis의 (II) 분석을 모니터링은 (i) 시간 코스 실험로 확장 할 수 있습니다. PALeO - TimeCourse 실험은 복잡한 proteolytic 경로 반응의 속도 - 제한 처리 단계 및 반응 중간체를 식별하는 데 도움이됩니다. 또한, PALeO 반응은 우리가 이러한 자사의 절단 제품을 rebind 및 제 18 O-원자의 결합을 catalyze 할 수있는 세린 프로테아제 트립신과 같은 proteolytic 효소를 식별 할 수 있습니다. 이러한 '이중 라벨'효소 postdigestion 18 펩티드가 독점적 카르 복실 산소 교환 반응에 의해 표시되는 O-라벨, 사용할 수 있습니다. 세 번째 전략은 효소 이상 18 O-농축 물을 고용 라벨 연장 18 O-안정 동위 원소 기호를 소개 산성 pH의 조건을 사용하여펩티드에 atures.

프로토콜

제시 LEO-워크 플로우는 단백질의 안정 동위 원소 라벨 요약 및 합성 펩티드를 위해 수 있습니다. 이 시간 코스 실험 (그림 1) 비교 및 정량 단백질 체학 연구뿐만 아니라 단백 분해 효소 연구에 적용 할 수 있습니다. 각 워크 플로우는 두 실험 단계 (그림 2)로 구성되어 있습니다 : A) 각 18 O-안정 동위 원소 인코딩 반응 (단백 분해 효소 - 촉매 펩타이드 절단의 해결 샘플링 시간, 단백 분해 효소 - 촉매 카르 복실 산소 교환 반응, 산 - 촉매 카르 복실 산소 교환 질량 분석법 18 O-정관의 속도론의 그래픽 표현에 의한 반응) 및 B) 분석.

A.의 TimeCourse 실험

I. PALeO - TimeCourse : proteolytic cleavages의 단백 분해 효소 - 촉매 라벨

  1. (선택 사항) 단백질 (10 μM) 및 펩티드 (250 μM)의 이황화 채권은 DTT (최종 농도 2.5 ㎜)로 감소25 MM의 NH 4 50 30 분에 부화하여 HCO 3 (모두 신선하게 조리 된) ° C.
  2. (선택 사항) 무료 cysteines는 iodoacetamide과 alkylated합니다 (최종 농도를 10 MM) 25 MM에 NH 4 HCO 3 어둠 속에서 실온에서 30 분에 부화하여.
  3. 관심 단백 분해 효소에 따라, 단백질 / 펩타이드 솔루션은 잔류 버퍼와 알킬화 에이전트를 제거하는 청소 업 있어야합니다. 단백질 샘플에 대한 버퍼를 교환 할 수 펩타이드 정리와 Vivaspin 원심 선기 (Sartorius)에 대한 PepClean C-18 스핀 열 (열)를 사용합니다.
  4. / Redissolve 교환 펩티드 / 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에 단백질 (ECE-1 : 50 MM MES - ​​코, 산도 5.5, 트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 1시 1분 (V / V) 마지막 H 2를 포함하는 18 O (95 %, 시그마 Isotec).
  5. 이전 단백 분해 효소의 추가에 제로 시점 샘플을 철회 : 믹스 반응 혼합물의 0.5 μl 및 0.5 μl 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic을산 매트릭스 (50 % 아세토 니트릴 10 MG / ML, 0.1 % TFA). Opti-TOF 384 든 대상 플레​​이트 (AB SCIEX)에 자리 샘플을하고 실온에서 용매 방울을 떠날 건조 할 때까지 (약 5 분).
  6. 이 aliquots에 반응 솔루션을 분할. 특정 효소에 대한 실내 온도 권장 온도 :; : 첫 나누어지는이 관심의 단백 분해 효소 (0.04 NM 트립신 75 NM ECE-1) incubated 수 있습니다. 두 번째 나누어지는이 단백 분해 효소없이 incubated 수 및 제어 샘플로 제공됩니다. 첫 번째 나누어지는이 단백 분해 효소 - 촉매 18 O-라벨에 대한 표준 샘플을 나타내며 proteolytic 절단 반응의 펩타이드 및 단백질 식별, proteolytic 활동 탐지 및 모니터링에 사용할 수 있습니다. 두 번째 나누어지는 18 O-정관은 단백 분해 효소에 의해 유도되는 표시하는 데 사용됩니다, 따라서,도 라벨이나 절단이 샘플에 대한 예상된다.
  7. 반응 aliquots를 제거하고 데로 놈들을 찾을 때까지 반응에 따라시간 간격으로 5 단계에서 cribed는 것은 적합한 것 같습니다. 위에서 설명한 반응 조건은 최대 네 일 (약 24 곳)에 대한 proteolytic 반응을 모니터링하는 데 사용됩니다. 30 분까지 매 5 분 샘플링 시작한 다음 사일 때까지 8 시간 모든 8 시간 때까지 2 시간까지 매 30 분마다 시간을 발견. 절단 제품은 처음 12 시간 내에 나타납니다과 기판은 24 시간 후에 완전히 분해해야합니다. 확장 반응 배양 시간이 더 처리 반응 중간체에서 이산 아르 안정적인 반응 제품을 정의 할 수 있습니다. 야생 시간과 배양 온도는 최적의 반응 샘플링을 보장 할 수 조절을 위해 연구 질문 및 주어진 효소 기판 쌍에 있습니다 따라.
  8. 최종 반응 시간 지점 발견되거나 (제 B) 아래에 설명 된대로 확장 야생 간격 사이에, 든 대상 플레​​이트는 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석에 제출 한 후.

II. PALeO - TimeCourse : Postdigproteolytic 테르 미니 (Termini)의 estion 라벨

  1. (선택 사항) 단백질 (10 μM) 및 펩티드 (250 μM)의 이황화 채권은 50 30 분 ° C.에 부화로 25 MM NH 4 HCO 3 (모두 신선하게 조리 된)에서 DTT (최종 농도 2.5 ㎜)로 감소
  2. (선택 사항) 무료 cysteines는 iodoacetamide과 alkylated합니다 (최종 농도를 10 MM) 25 MM에 NH 4 HCO 3 어둠 속에서 실온에서 30 분에 부화하여.
  3. 관심 프로테아제에 따라, 단백질 / 펩타이드 솔루션은 잔류 버퍼와 알킬화 에이전트를 제거하는 청소 업 있어야합니다. 단백질 버퍼 교환을위한 펩타이드 정리와 Vivaspin 원심 선기에 대한 PepClean C-18 스핀 열을 사용하십시오.
  4. Redissolve / 청소 업 펩타이드 제품 / 단백질 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에 (예 트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 교환 (예 : 트립신 완료의 관심 단백 분해 효소와와 다이제스트를 : 0.04 NM, 37 ° C, 12 시간).
  5. PepClean C-18 스핀 열 정리 절단 제품. 이 단계는 잔류 단백 분해 효소 활동을 제거합니다.
  6. Redissolve / (트립신 : 25 MM NH 4 HCO 3, 산도 8.0) 20 μl 단백 분해 효소 반응 버퍼에서 청소 업 펩타이드 제품을 교환 1시 1분 (V / V) 마지막 H 2 18 O를 포함
  7. 이전 효소의 추가에 제로 시점 샘플을 철회 : 반응 혼합물 및 0.5 μl 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 매트릭스 (10 MG / 50 % 아세토 니트릴의 ML, 0.1 % TFA)의 믹스 0.5 μl합니다. 든 대상 접시에 자리 샘플을과 (5 분 정도) 건조 될 때까지 실온에서 용매 방울 둡니다.
  8. 이 aliquots에 반응 솔루션을 분할. 특정 효소에 대한 실내 온도 권장 온도 : 첫 나누어지는이 관심 단백 분해 효소 (0.04 NM 예 트립신)에 incubated 수 있습니다. 두 번째 나누어지는이 단백 분해 효소없이 incubated되고 제어 될 것입니다. 첫 번째나누어지는이 단백 분해 효소 - 촉매 18 O-postdigestion 라벨에 대한 표준 샘플을 대표하는 펩타이드 및 단백질 정량화 사용할 수 있습니다. 두 번째 나누어지는 18 O-정관은 단백 분해 효소에 의해 촉매되는 표시하는 데 사용됩니다, 따라서 어떤 라벨이 샘플에 대한 기대하지 않습니다.
  9. 반응 aliquots을 제거하고 그들에게 7 단계에 설명 야생하여 반응을 수행합니다.) 시간 간격으로는 적합 같습니다. 예를 들어, 우리는 트립신에 의해 촉매 카르 복실 산소 교환 반응을 모니터링하기 위해 그 후 처음 30 분, 매 15 분에 매 5 분을 발견.
  10. 최종 반응 시간 지점 발견되거나 (제 B) 아래에 설명 된대로 확장 야생 간격 사이에 든 대상 플레​​이트는 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석에 제출 한 후.

III. ALeO - TimeCourse : 카르 복실 그룹의 산 - 촉매 라벨

  1. 1시 1분 (V / V) t 18 O-농축 물과 개별 펩티드 (50 NM)를 품다그 존재 또는 0.1 %의 부재 (제어) (V / V) 마지막 trifluoroacetic 산성 (총 볼륨 30 μl).
  2. 샘플로 48일에 대한 일일 반응 제품을 직접 든 대상에 알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 매트릭스 (10 MG / 50 % 아세토 니트릴의 ML, 0.1 % TFA)의 0.5μl과 혼합물의 0.5 μl 나누어지는을 공동 스포팅 판.
  3. 야생 간격 사이 제 B.에서 아래에 설명 된대로 MALDI-TOF/TOF MS / MS 분석을 위해 든 대상 플레​​이트를 제출 최종 반응 시점의 스포팅 후

B. MALDI-TOF/TOF는 MS / MS 데이터 수집 및 분석

  1. 질량 스펙트럼은 4,800 든 TOF / TOF 분석기 (AB SCIEX)에 인수되어 있습니다.
  2. 이전 분석에, 악기는 ± 50 PPM과 일치이 6 봉우리의 최소 수의 최대 질량 측정 오류 허용과 펩타이드 표준 혼합 (AB SCIEX TOF / TOF 악기의 보정을위한 대중 표준 키트)로 교정된다.
  3. MS 스펙트럼 (질량 범위2000의 허용 기준 피크 강도 범위 단계 크기 50 개) - 45,000, 400 - 3800 - 4,000미터 / Z)를 조절 레이저 강도 (3400과 긍정적 인 이온 모드를 사용하여 세중의에 인수되어 있습니다. 싱글 샷은 400 총 촬영 / 스펙트럼과 하위 스펙트럼에 대한 인수 아르, 800 하위 스펙트럼 후 효력 조건을 중지 (통과 또는 실패) 획득거나 400 하위 스펙트럼 패스 승인 기준. 낮은 풍부한 샘플의 경우 나 복잡한 생물학적 배경의 존재에 MS 감지 범위의 하단 끝은 800m / z로 제기해야합니다. 또한, LC 분리 또는 앞에서 설명한대로 샘플 정리 단계로 소금 및 기타 방해 물질을 제거해야 할 수도 있습니다.
  4. MS 데이터 파일 (. t2d 파일)은 4000 시리즈 Explorer에서 데이터 수집 소프트웨어에서 수출 및 스펙트럼 처리 및 피크 검출을위한 마스코트 증류기 소프트웨어 (매트릭스 과학)를 활용하여 자사 실험실 정보 시스템으로 가져옵니다. Isotopic 봉투deconvoluted 자동으로 메이슨 외. 12 설명 및 그룹 9 적응 하나와 유사한 알고리즘을 사용하여 결정 18 O-정관 비율입니다. 또한, 이러한 ZoomQuant 13 바이퍼 14와 같은 소프트웨어 도구뿐만 아니라 상용 소프트웨어 패키지는 BioWorks 익스프레스 (열 피셔 과학)과 마스코트 증류기 Quantitation 상자로 (매트릭스 과학) 18 O 형 데이터 15,16를 deconvolute 할 수 있습니다. 18 O-설립 비율이 (예를 들면, 16를 포함하는 펩티드 각각의 펩타이드 동위 원소 종의 상대적 기여로 표현됩니다 O, 전체 isotopic 봉투 18 O 1 또는 18 O 2).
  5. 각 TimeCourse 실험 들어, 분자 질량 ([M + H] +) 검색된 모든 펩타이드 종은 관련 MS 데이터 파일에서 추출하고 값은 100 PPM 질량 폭에 binned하는 것입니다.
  6. 최소 t 세 [M + H] + bin을 입력해야하도록 설정되어 있습니다. 알려진 기판의 경우, 필터링 빈 목록은 ExPASy FindPept 도구 17 조 (사용 기판 펩타이드 시퀀스에서 예측 proteolytic 절단 제품의 목록과 비교됩니다 http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) 및을 200 PPM 질량 오류 접수 허용.
  7. MS / MS 스펙트럼은 FindPept 도구에 의해 그들과 관련된 18 O-incorporations이 빈 값에 대한 예측 절단 제품의 대량 값을 취득합니다. MS / MS 데이터가 오프 모드에서 고정 된 레이저 4,200의 강도와 CID-가스, 1kV 반사기 긍정적 인 이온 모드에서 4,800 든 TOF / TOF 분석기에 인수되어 있습니다. 50 발이 지점 40 하위 스펙트럼 (2,000 샷 / 지점의 총 항복)의 총에 하위 스펙트럼 당 무작위 패턴에 인수되어 있습니다.
  8. MS / MS 데이터 파일 (. t2d 파일)은 4000 시리즈 Explo에서 수출 아르RER 데이터 수집 소프트웨어와 자사 실험실 정보 시스템에 수입은 봉우리가 발견되어 MS / MS 피크 목록은 해당 binned MS 데이터와 연결되어 있습니다.
  9. 펩타이드 식별를 들어, MS / MS 피크 목록은 다음 검색 매개 변수를 사용하여 마스코트 검색 엔진을 사용하여 SwissProt 데이터베이스에 대해 검색하지 않습니다 : 더 효소 특이성, 150 PPM 전구체 이온과 0.2 다 조각 이온 질량 오차합니다.
  10. 펩타이드 식별이 추가로 솁 첸코 외 의해 설명 된대로 Y-시리즈 조각 이온에 걸쳐 특성 18 O-결합 패턴을 확인하여 데이터 탐색기 소프트웨어 (AB SCIEX)를 사용하여 유효성을 검사 할 수 있습니다. 18.

스펙트럼 시간 18 O-정관 플롯의 C. 준비

스펙트럼 시간 플롯 :를 사용하여 각 반응 시간 지점에 대한 MS 데이터 파일 (. t2d 파일)로 데이터 탐색기 소프트웨어에서 내 보낸 ASCII-파일매크로와 데이터 분석 및 그래픽 소프트웨어 프로그램 (OriginLab의 예 유래)로 수입 폭포 플롯 (그림 3)으로 표시됩니다.

18 O-정관의 플롯 : 각 binned 펩타이드 절단 제품에 대한 개별 펩티드 동위 원소 종의 상대적 기여 (16 O, 18 O 1 또는 18 O 2) 모든 반응 시간 지점에서 추출하고 (그림 4) 시간이 역모를 꾸몄다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

우리는 동적으로 proteolytic 효소에 의해 생성 된 펩타이드 절단 제품에 18 O-안정 동위 원소의 결합을 모니터링 할 PALeO-TimeCourse 워크 플로를 사용했습니다. 제시 방법은 비교적 다른 기판과 단백 분해 효소의 조합에 대해 proteolytic 처리 경로를 연구 할 수있는 다양한 도구입니다. 반응의 과정을 통해 반복적으로 proteolytic 반응을 샘플링하여 PALeO-TimeCourse 실험은 기판 및 제품 abundances의 시간 해결 스냅 샷 및 처리 정보를 제공합니다. 공동 야생 대상 접시에 산성 매트릭스 솔루션 샘플을하면 효소 반응과 매트릭스 결정이 더 샘플 구성을 보존하지 않습니다. 따라서, 시간 포인트는 소급 효소 반응의 결론 후 MALDI-TOF/TOF MS / MS에 의해 분석 할 수 있습니다. 이러한 실험 워크 플로우의 데이터 풍부한 자연을 수용하기 위해, 우리는 18 O-incorporat을 계산 반자동 생물 정보학 시스템을 구현각 펩타이드....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

안정 동위 원소 라벨과 시간이 해결 방법으로 고해상도 질량 분광법을 결합하여 PALeO-TimeCourse 방법은 펩타이드 제품의 세대의 동적 분석을 할 수 있습니다. 분석은 양적 및 질적 단백질 체학 연구를위한 안정적인 isotopically 표시 펩티드를 생성하고 proteotypic 펩티드가 생성되는이 반응 속도론을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, PALeO-TimeCourse는 특정하지 않다는 관련 조건 예를 생체에서 proteolytic 경로를 평가하기 위해 설계되었습니다. 내생 단백질, 펩티드 및 프로테아제뿐만 아니라 합성 펩티드 및 재조합 프로테아제는 워크 플로우에 활용 할 수 있습니다. 특정 proteolytic 조사 할 반응, 검정 조건 및 야생 시간에 따라이 반응 과정의 최적 샘플링을 제공하기 위해 조정할 수 있습니다. 우리의 경험에서는 (예를 들면 낮은 효소 농도를 사용하여, 방 다운 proteolytic 반응을 천천히 도움이 될 것입니다편리한 수동 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

이 작품은 NIH / NIDCR 부여 1R01DE019796에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
물질의 이름 회사 카탈로그 번호
PepClean C-18 스핀 열 열 89,870
Opti-TOF 384 든 대상 판 AB SCIEX 1016629
4800 든 TOF / TOF AB SCIEX

표 1. 자료

시약의 이름 회사 카탈로그 번호
알파 시아 노-4-hydroxycinnamic 산 시그마 알드리치 70990-1G-F
소 혈청 알부민 (BSA) 시그마 알드리치 A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) Acros 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) 시그마 알드리치 1149-5G
엔도 테린은 효소-1 (ECE-1) 변환 R & D 시스템 1784 - 아연
트립신 골드 Promega V5280
물-18 O, 97 원자 % 18 O 시그마 알드리치 329878-1G
Trifluoroacetic 산 (TFA) 열 28,904
AB SCIEX TOF / TOF 악기의 보정을위한 대중 표준 키트 AB SCIEX 4333604

표 2. 시약

참고문헌

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156(2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

18PALeOMALDI TOF MS

관련 논문