방법 논문

'단일 바이러스 게놈'을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

DOI:

10.3791/3899

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2013년 5월 26일

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1Department of Microbial and Environmental Genomics, The J. Craig Venter Institute

이 논문에서

요약

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단일 바이러스 게놈 (SVG)는 단일 virons의 게놈을 분리하고 증폭하는 방법이다. 혼합 조립의 바이러스 현탁액하여 virion의 캡처 및 다운 스트림 처리하는 동안 게놈 전단을 줄이고, 아가로 오스를 포함하는 개별 우물 현미경 슬라이드에 유동 세포 계측법을 사용하여 정렬됩니다. 전체 게놈 증폭 시퀀싱에 적합한 유전 물질의 결과로 여러 변위 증폭 (MDA)를 사용하여 수행됩니다.

초록

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단일 미생물 세포의 전체 게놈 증폭 및 염기 서열 재배 1-3의 필요없이 게놈 특성화 할 수 있습니다. 유비쿼터스와 우리의 행성 4에서 가장 많은 엔티티와 모든 환경 5 중요한 바이러스, 유사한 접근 방식을 통해 밝혀 질 못하고있다. 여기에서 우리는 '단일 바이러스 게놈'(SVG)라는 단일 비리의 게놈을 분리하고 특성화 방법을 설명합니다. SVG 후속 시퀀싱 반응에 사용할 수있는 고 분자량의 게놈 DNA (gDNA를)을 얻기 위해 각각의 바이러스 전체 게놈 증폭을 분리하는 유동 세포 계측법을 사용합니다.

프로토콜

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1. 바이러스 정학의 준비

유동 세포 계측법을 통해 단일 ​​비리의 분리하기 전에, 고정되지 않은 바이러스 현탁액을 준비합니다.

  1. 반드시 최종 바이러스 현탁액을 만들기 이전에 설정된 프로토콜을 사용하여 바이러스 입자를 분리하는 것은 0.1에 포함되어 μm의 여과 TE (트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8). 다른 방법은 해당 사용 화학 응집 7 개발되어 있지만, 우리는 접근 접선 흐름 여과 (TFF)를 사용하여 6을 추천합니다.
  2. 예를 들어, epifluorescence에 8-10 또는 유동 세포 계측법 11,12을 사용하여 설정 프로토콜을 사용하여 바이러스 입자를 열거합니다.
  3. 두 에펜 도르프 튜브 (최종 부피는 1,000 μL 할 것을 권장합니다)로 나누어지는 바이러스 현탁액을.

2. 유동 세포 계측법

  1. 사용자 정의 포워드 분산 PMT (FSC PMT)가 장착 BD FACSAria II 흐름 cytometer에를 사용하여 바이러스를 정렬하려면, 0.1에서 바이러스 입자를 희석 TE, p....

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토론

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SVG 방법을 적용 할 때 중요한 요소의 수를 고려해야합니다. 유전자형은 개념 증명 실험 13에서 수행 한대로 보존 된 프라이머는 모든 바이러스 그룹에서 사용할 수없는 환경 적 또는 알 수 분리에 대한 올바른 옵션이 아닙니다. 또한, 배경 DNA 합성이나 비특이적 인 증폭은 일반적으로 MDA 반응 14를 사용하여 증폭하는 동안보고됩니다. 비특이적 증폭 반응 시약 및 / 나 반응 혼합물 내의 임의의 hexamers의 증폭을 가능하게하는 메커니즘을 통해 새로운 DNA의 오염에 기인하고있다. 바이러스 군집 작업을 할 때, 우선적으로 (때문에 입자의 유의 한 차이 (셀) 크기와 게놈 DNA 내용의 결과로 하나의 박테리아 세포에 반대하는 템플릿 바이러스 DNA의 낮은 수량을 증폭 특이 DNA를의 높은 가능성은 아마도이 25-100 nm의, 바이러스에 대한 ~ 1.5 FG 등0.2-1.5 음이 아닌, 박테리아 ~ 14 FG). DNase의 I, CLSM을 사용하여 아가로 오스 비즈를 포함하는 바이러.......

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 원고 준비 과정을 통해 자신의 통찰력과 조언 켄 Nealson에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1X TE 버퍼Invitrogen12090-015
버퍼 포화 페놀Invitrogen15513-039
GenomiPhi HY 키트GE Healthcare25-6600-22
GlycoblueInvitrogenAM951615 mg/ml
LMP 아가로스Invitrogen16520100
PTFE 현미경 슬라이드전자 Microscopy Sciences63430-0424 well, 4 mm Diameter
SybrGreenInvitrogenS758510,000X
β-agaraseNew England BiolabsM0392S

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
  2. Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10,....

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재인쇄 및 허가

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Single Virus GenomicsFlow Cytometry SortingWhole Genome AmplificationConfocal Microscopy ValidationMultiple Displacement AmplificationHigh Throughput SequencingBioinformatic AnalysisViral Genome AssemblySingle Virion IsolationGenome Amplification

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