에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑 대장균 합성 유전자 배열을 사용하여

요약

체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이 칭했다 대장균.

초록

Phenotypes는 물리적 (단백질 단백질 등) 및 기능 (예 : 유전자 - 유전자 또는 유전자)의 상호 작용 (GI) ^1의 복잡한 일련의에 의해 결정됩니다. 물리적 상호 작용은 세균의 단백질은 단지로 등록 된 표시 할 수 있지만, 반드시 경로 수준의 기능 relationships1를 공개하지 않습니다. 이 삭제되거나 inactivated 유전자를 베어링 더블 돌연변이의 성장을 측정하고 해당 단일 돌연변이에 비해되어있는 GI 화면, loci 사이 epistatic 종속성을 조명하고 따라서 새로운 기능의 관계 ² 검색하고 발견 할 수있는 수단을 제공 할 수 있습니다. 대형 GI지도는 효모 ^3-7과 같은 진핵 생물에 대해보고 있지만, GI 정보는 박테리아 genomes의 기능 주석을 방해 prokaryotes ^8에 대한 희박한 유지되었습니다. 이를 위해, 우리와 다른 사람들은 높은 처리량 정량 세균 GI 검사 방법 ^{9, 10을} 개발했습니다 여기, 우리는 양적 E.를 수행하는 데 필요한 주요 단계를 제시 체계적으로 생성하고 식민지 배열 형식의 이중 돌연변이 다수의 피트니스을 측정하기 위해 자연 박테리아 활용과 상동 재조합을 사용하여 대장균 게놈 규모의 ⁹ 합성 유전자 배열 (eSGA) 심사 절차. 간단히, 로봇이 전송하는 데 사용됩니다 , 활용을 통해 chloramphenicol (CM)는 - 마크 F-받는 종자 - 엔지니어링 Hfr에서 돌연변이 대립 유전자 (재조합 높은 주파수) kanamycin의 정렬 배열 (관)에 '기증자 변종'을 표시했습니다. 일반적으로, 우리는에 손실 기능을 중요하지 않은 유전자 삭제를 베어링 단일 돌연변이 ( '케이'컬렉션 ¹¹ 예)와 필수 유전자 hypomorphic 변이를 (감소 단백질 표현, 안정성, 또는 활동 ^{9, 12, 13를} 부여 즉 대립 유전자)를 사용 중요하지 않은, 필수 유전자, 고해상도의 기능 연관을 쿼리pectively. 상동 재조합에 의해 활용하고 다음의 유전자 교환 인한 후, 결과를 두 번 돌연변이는 모두 항생제를 포함하는 고체 매체에 선택됩니다. 가지 후, 플레이트는 디지털 이미징하고 식민지 크기는 양적 내부 자동 이미지 처리 시스템 ^14를 사용하여 채점하고 있습니다. GIS는 이중 돌연변이의 성장 속도가 예상보다 ⁹ 중 훨씬 더 나은 또는 더 나쁜 경우 공개됩니다. 악화 (또는 부정적) GIS는 종종 같은 필수 과정 ² 가해진 보상 경로에서 유전자 쌍의 손실 기능 돌연변이 사이에 발생. 여기 하나의 유전자의 손실은 단일 돌연변이가 가능한이 같은 것을 버퍼입니다. 그러나 두 경로의 손실이 해로운이며, 합성 lethality 또는 질병 (즉, 느린 성장)에 발생합니다. 반대로, 경감 (또는 긍정적) 상호 작용과 같은 경로 나 복잡한 단백질 ² 유전자 사이에 발생할 수 있습니다혼자 두 유전자의 삭제는 종종 경로 또는 추가 섭동 더, 따라서 성장을 활동을 줄이고하지 않는 등 단지의 정상적인 기능을 교란하기에 충분합니다. 전반적으로, 체계적으로 파악하고 GI 네트워크를 분석하는 것은 다른 방법으로 놓친 경로 수준의 정보가 ⁹ 유추 할 수있는 유전자, 많은 수의 사이의 기능적 관계의 편견, 글로벌지도를 제공 할 수 있습니다.

프로토콜

1. Recombineering ^{15, 16} Hfr 카발리 기증 돌연변이 변종을 구축

eSGA 기증자의 얼룩를 만들기위한 단계는 아래에 설명되어 있습니다. 간단히, 우리는 대상 λ를 사용하여 - 빨간색은 중요하지 않은 유전자 삭제 뮤턴트 (섹션 1.1) 또는 다음으로 사용됩니다 필수적인 유전자 hypomorphic 돌연변이 기증 변종 (1.2 항)을 만들 PCR에 의해 생성 된 증폭 선택 DNA 마커 카세트의 상동 재조합 ¹⁶ 조각을 중재 GI 네트워크를 정의하는 '쿼리'.

참고 : 기술 개발 과정에서, 우리는 잘 정의 된 Hfr 기증자 스트레인 (Hfr 카발리, Hfr 헤이즈, 그리고 Hfr 3000)를 사용하여 변이를 조합에 Hfr로 인한 conjugative 전송을 사용의 효과를 평가합니다. 우리는 (i) 효율적으로 유 외에 의해 개척 recombineering 방법을 사용하여 기증자 돌연변이를 만들 수있는 능력을 조사했다. (2000) ^16, (ii)의 상대적 효율성conjugative DNA의 서로 다른 염색체 마커 전송, 그리고 (i....

결과

GI는 유전자 간의 기능적 관계를 나타냅니다. 마찬가지로, 동일한 경로에 있는 유전자는 유사한 GI 패턴을 나타내고 GI 프로파일 유사성은 표현형의 일치성을 나타내기 때문에 GI 프로파일을 클러스터링하여 기능적으로 관련된 유전자를 경로로 그룹화할 수 있습니다. GI 및 GI 상관 관계 네트워크를 물리적 상호 작용 정보 또는 게놈 컨텍스트(GC) 관계와 같은 기타 연관 데이터와 통합하면 박테리아의 핵심 생물학적 시스템(및 시스템 누화)을 정의하는 고차원 기능 모듈의 조직도 밝힐 수 있습니다. 예를 들어, 효모^{4, 6, 7, 26}과 마찬가지로, 높은 상관관계가 있는 GI 프로파일을 갖는 완화 상호작용을 보이는 대장균 유전자 쌍은 물리적으로 연관된(예: 복합체를 형성하고; 그림 4a) 또는 일반적인 생화학적 경로(예: 선형 캐스케이드의 구성 요소)에서 일관되게 작용합니다. 대표적인 예가 그림 4b에 나타나 .......

토론

우리는 GI을 조사하여 경로 수준에서 박테리아 유전자 기능을 조사하기 위해 로봇 eSGA 검사를 사용하기위한 단계 - 현명한 프로토콜을 설명하고 있습니다. 이 접근 방식은 E.에서 개별 유전자뿐만 아니라 전체 생물 시스템을 연구하는 데 사용할 수 있습니다 대장균. 조심스럽게 모든 적절한 컨트롤을 포함 위에서 설명한 실험 단계를 실행하고, 엄격하게 분석하고 독립적으로 GI 데이터가 새로운 기능 발견을 만드는 eSGA의 성공을 위해 중요한 요소 아르 확인. eSGA, E.에 GI를 연구를위한 개념적으로 유사한 방법 외에 대장균은 거대한 - 대장균 ¹⁷ 칭했다, 종종 proteomic ²³ 나 혼자 phenotypic ¹³ 화면과 같은 다른 방법에 의해 놓친 아르 소설 기능의 관계를 조명하는 데 사용할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 모든 게놈 차원의 접근 방식과 마찬가지로 제한이 예를 들어 다른 세균 종까지.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
I. 항생제
Chloramphenicol	Bioshop	#CLR201
Kanamycin		#KAN201
Ampicillin		# AMP201
2. Luria-Bertani 미디엄 < / 스트롱 >
LB 파우더	Bioshop	#LBL405
Agar	Bioshop	#AGR003
3. 박테리아 균주 및 플라스미드
Hfr Cavalli 균주 λ red system (JL238)	Babu et al.14.
pKD3	E. coli Genetic Stock Centre, Yale
Keio E. coli F- 수혜자 컬렉션	일본 국가 생물 자원 프로젝트(NBRP)11
Hypomorphic E. coli F- SPA 태그 균주	Open biosystems; Babu et al.14
4. 프라이머
pKD3 기반 탈염 상수 프라이머			F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
탈염 맞춤형 프라이머			Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
탈염 맞춤형 프라이머			F2 및 R2: pKD3 서열에 기초한 20 nt 불변 영역 및 45 nt 사용자 정의 상동성 영역 F2 상수 영역: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 상수 영역: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 및 S2: SPA-Cm 카세트의 증폭을 프라이밍하기 위한 27 nt 불변 영역 및 45 nt 사용자 정의 상동성 영역 S1 상수 영역: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 상수 region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F 및 KOCO-C: 비필수 유전자 결실 부위 또는 필수 유전자 SPA 태그 삽입 부위에서 200bp 떨어진 20nt 프라이머
5. PCR 및 전기영동 시약
Taq DNA 중합효소	발효	# EP0281
10X PCR 완충액	발효	# EP0281
10 mM dNTP	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
로딩 염료	NEB	#B7021S
에티듐 브로마이드	Bioshop	# ETB444
10X TBE 완충액	Bioshop	# ETB444.10
트리스 베이스	Bioshop	# TRS001
붕산	Sigma	# T1503-1KG
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# B6768-500G
DNA ladder	NEB	#N3232L
6. DNA 분리 및 클린업 키트
Genomic DNA 분리 및 정제 키트	Promega	#A1120
Plasmid Midi kit	Qiagen	# 12143
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	#28104
7. PCR, 형질전환 및 복제 장비-피닝
열 cycler	, BioRad, iCycler
아가로스, 겔, 전기영동,	BioRad, Electroporator
	Bio-Rad, GenePulser II
0.2 cm electroporation cuvette	Bio-Rad
42 ° C 수조 쉐이커	Innova 3100
Beckman Coulter TJ-25 원심분리기	Beckman Coulter
32 ° C 셰이커	뉴브런즈윅 사이언티픽, 미국
32 ° C 플레이트 인큐베이터	Fisher Scientific
RoToR-HDA 벤치탑 로봇	Singer Instruments
96, 384 및 1,536 핀 밀도 패드	Singer Instruments
96 또는 384 긴 핀	Singer Instruments
8. 이미징 장비 < / 강력 >
카메라 스탠드	Kaiser
디지털 카메라, 10 메가 픽셀	모든 공급 업체
라이트 박스, Testrite 16 "x 24"단위	Testrite
9. 패드 또는 플레이트 재활용
10% 표백제	모든 공급업체
70% 에탄올	모든 공급업체
멸균 증류수	모든 공급업체
플로우 후드	모든 공급업체
자외선 램프	모든 공급업체
10. 실험기구
>50ml 폴리프로필렌 튜브	모든 공급업체
1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브	모든 공급업체
250ml 원추형 플랙	VWR	# 29140-045
15ml 멸균 배양 튜브	Thermo Scientific	# 366052
극저온 바이알	VWR	# 479-3221
직사각형 플레이트	Singer Instruments
96-웰 및 384-웰 마이크로타이터 플레이트	Singer Instruments	Nunc
플레이트 롤러는 멀티웰	Sigma	#R1275
	ABgene	# AB-0580
접착 플레이트 씰	Fisher Scientific	# 13-990-14-80
° C 냉동고	모든 공급 업체