이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

22.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

2013년 1월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

B7-H1 (PD-L1) 및 PD-1의 바인딩은 종양의 microenvironment의 주요 종양 유발 면역 신호를 제공합니다. 표현과 췌장 선암의 B7-H1의 국산화를 특성화 할 수 immunohistochemical 얼룩 기법이 여기에 설명되어 있습니다.

초록

B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8.

최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 mul에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암을 포함 tiple 인간의 고체 종양.

결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 ​​개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 개발자가췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 사랑의 도피를 떠났을 B7-H1의 착색 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다.

프로토콜

B7-H1/PD-L1, 면역 규제 세포 표면 단백질의 B7 가족의 일원은 (PD 프로그래밍 사망-1, 그 수용체와의 상호 작용을 통해 세포 매개 면역 반응의 부정적인 규제에 중요한 역할을 -1) 1,2. 종양 세포의 B7-H1의 Overexpression는 흑색 증, glioblastoma, 그리고 폐, 유방, 대장, 난소 및 신장 세포의 carcinomas을 포함 인간 암의 숫자에 기록되었으며, 항 종양 저해하는 표시되었습니다 T를 세포 면역 3-8.

최근 췌장 선암의 조직에 의해 B7-H1 표현은 잠재적 인 전조 마커 9,10로 확인되었습니다. 또한 췌장암의 마우스 모델에서 B7-H1의 봉쇄는 안티 종양 응답 11 생산 보여왔다. 이러한 데이터는 잠재적 인 치료 목표로 B7-H1의 중요성을 권장합니다. 안티 - B7-H1의 봉쇄 항체 따라서 여러 인간에 대한 임상 실험에서 테스트되고 있습니다흑색 증과 폐, 대장, 신장, 위장, 췌장 (12)의 암 등의 고체 종양.

결국 치료를 타겟으로 B7-H1의 혜택을받을 환자를 식별 할 수 있도록 위해서는 표현과 B7-H1과 B7-H1의 봉쇄 항체 치료에 대한 환자 반응의 국산화 사이의 상관 관계를 조사하는 것이 중요합니다. immunohistochemistry를 통해 인간의 췌장 선암의 조직에서 B7-H1의 표현을 조사하면이 공동 억제 신호 분자가 종양의 microenvironment에 antitumor 면역의 억제에 기여하는 방법에 대한 이해를 제공 할 것입니다. 첸과 동료에 의해 ​​개발 된 안티 - B7-H1 단클론 항체 (클론 5H1)가 인간의 neoplastic 조직 4,8의 여러 유형의 cryosections에서 신뢰할 수있는 염색 결과를 생산하기 위해 표시하지만, 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 얼룩되었습니다 것은 때까지 도전이었다 최근 13-18. 우리는 B7-H1 staini을 개발했습니다췌장 선암의 조직의 파라핀 - 임베디드 슬라이드에 대한 것이다 프로토콜. 여기에 설명 된 B7-H1의 착색 프로토콜은 약간의 배경 B7-H1의 일관성 막과 세포질 염색을 생산하고 있습니다.

1. 드 - parafinization

  1. 구워 20 분에 55 ° C에서 슬라이드.
  2. 10 분을위한 크실렌의 화학 후드에서 잠그다는 슬라이드.
  3. 10 분에 대한 새로운 크실렌에 젖어 슬라이드.
  4. 젖어은 5 분 동안 100 %의 에탄올에 슬라이드.
  5. 빠져 5 분을위한 신선한 100 % 에탄올에 슬라이드.
  6. 젖어은 5 분 동안 95 %의 에탄올에 슬라이드.
  7. 젖어은 5 분 동안 80 % 에탄올에 슬라이드.
  8. 젖어은 5 분 동안 탈 이온수에 슬라이드.

2. 항원 불러 오기

  1. 그리고 125 ° C 30 초를위한 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 (산도 9.0)과 압력 밥솥의 열, 90 ° 10 초에 C에 젖어 슬라이드.
  2. 60 분에 슬라이드가 멋진 보자.
  3. 5 분에 TBST에 빠져 슬라이드, repe두 번에.

3. 더럽히는 것

  1. 슬라이드에 조직 주위에 솔루션을 닦아. 소수성 펜으로 조직 주위에 원을 표시합니다.
  2. 습도 챔버에 슬라이드를 삽입하고 전체 염색 과정에서 슬라이드의 조직의 건조를 방지. 5 분에 퍼 옥시 데이즈 블록에서 슬라이드 및 품다 슬라이드에 소수성 원에서 퍼 옥시 데이즈 블록의 장소 한 방울 (완전히 조직 영역을 커버하기 위해 약 200 μl 이상).
  3. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어.
  4. BLOCK ACE 장소 한 방울로 15 분 각 슬라이드 및 배양에 버퍼를 차단.
  5. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어.
  6. 15 분 각 슬라이드 및 배양에 아비딘 솔루션의 장소 한 방울.
  7. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어.
  8. 15 분 각 슬라이드 및 배양에 비오틴 솔루션의 장소 한 방울.
  9. SLI를 씻어TBST로 DES, 5 분에 TBST에서 다음 장소.
  10. 마우스 방지 B7-H1 단클론 항체의 1:1,000 희석 (복제 5H1) 또는 마우스 IgG1과 함께 슬라이드를 배양 4에 200 μl TBST에서 κ isotype 제어 ° C 22 시간 + / 밤새 - 1 시간. TBST의 최종 항체 농도는 2.57 μg / ML입니다.
  11. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
  12. 30 분의 1:500 농도에서 비오틴 복합 쥐 안티 - 마우스 IgG1 항체 보조 (200 μl 2 % 염소 혈청 솔루션)에 슬라이드를 품다.
  13. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
  14. Streptavidin-비오틴 복합체 대신 한 방울은 15 분 각 슬라이드 및 배양에 (사용 전에 적어도 30 분을 준비해야합니다.)
  15. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
  16. 4 분 각 슬라이드 및 배양에 증폭 시약 대신 한 방울 (TBST로 2시 1분을 희석).
  17. T와 슬라이드를 씻어영국 서머 타임, 5 분에 TBST에서 다음 장소. 두 번 반복합니다.
  18. 15 분 각 슬라이드 및 배양에 Streptavidin-HRP 대신 한 방울.
  19. 5 분에 TBST에서 발생 후, TBST로 슬라이드를 씻어. 두 번 반복합니다.
  20. 각 슬라이드에 하나 3,3-Diaminobenzidine의 드롭 (DAB) 기판과 chromogen을 놓고 2 분의 색상을 개발합니다.
  21. 즉시 색상 개발 한 후, 1-2 분 동안 ddH 2 O로 슬라이드를 씻으십시오.
  22. 90 초 동안 hematoxylin 한 방울과 슬라이드를 품다.
  23. 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오.
  24. 1-2 분 동안 비누의 수돗물로 씻으십시오.
  25. 1-2 분 동안 ddH 2 O로 씻으십시오.

4. 탈수 및 장착

  1. 3 분에 80 % 에탄올에 슬라이드를 빠져.
  2. 3 분에 95 %의 에탄올에 슬라이드를 빠져.
  3. 5 분을위한 100 % 에탄올에 슬라이드를 빠져. 반복합니다.
  4. 5 분에 크실렌에서 슬라이드를 빠져. 반복합니다.
  5. 한 방울을 추가슬라이드과 장소 coverslip에 Cytoseal 60.

표 1은 위에서 설명한 절차에 사용되는 시약을 나열합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

B7-H1의 성공적인 immunohistochemical 얼룩은 췌장 선암의 B7-H1 (갈색 신호 DAB 색상 개발)의 이기종 표현을 보여줍니다. 다른 B7-H1 또는 B7-H1 (도 2 및도 3)의 작은 표현 중 하나 주로 세포질 표현을 할 수 있지만 일부 췌장 선암 세포는 B7-H1의 주로 막 표현 (그림 1A)를 갖추고 있습니다. 일반 췌장 덕트 상피는 (그림 4) B7-H1 약간을 표현한다. 마우스 IgG1 κ isotype 제어 항체와 얼룩 대신 반 B7-H1 항체의 것은 약간의 배경 착색 (그림 1B)를 보여줍니다.

figure-results-1
1 그림. 반 B7-H1과 A. Immunohisto...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

cryosections에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색은 암 3,4의 다양한 사전 연구에서보고되었습니다. 그러나, 임상 종양 샘플을 일반적으로 파라핀 - 임베디드 블록의 형태로 사용할 수 있습니다. 5H1 단클론 항체는 최근 성공적으로 신장 세포 암종, 자궁 경부 암, 방광 암, 흑색 증 13-18 등의 파라핀 포함 된 종양 조직의 착색에 적용되었습니다. 파라핀 - 임베디드 9,19 또는 그라 이오 스탯 다른 단클론 항체와 췌장 선암의 조직의 20 섹션에서 B7-H1의 얼룩도보고되었습니다. 여기, 우리는 B7-H1에 5H1 단클론 항체와 파라핀 - 임베디드 췌장 선암의 조직을 성공적으로 착색을 보여 주었다. 췌장 선암의 B7-H1의 표현은 흑색 증 4,21 등 malignancies의 많은 다른 유형의 것과 유사 이기종입니다. B7-H1 AR의 막과 세포질 모두 표현e는 선암 세포 (그림 1...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

EB, KMB, 그리고 HX 동일하게 기여하고 있습니다. 이 연구는 위장 암 P50 CA062924, NIH K23 CA148964, Lustgarten 재단, Viragh 재단, ASCO 젊은 연구자 상, NIH 5T32 CA0090701-28 교육 교부금, 솔 골드만 삭스의 췌장암 센터, 국립 췌장 재단에서 NCI의 포자에 의해 지원되었다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
CSA 시스템 Dako K1500 퍼 옥시 데이즈 블록, streptavidin-비오틴 단지, 증폭 시약, streptavidin-HRP 및 DAB 기판과 chromogen 다음 프로토콜에 언급 된 시약을 포함
아비딘 / 비오틴 차단 키트 벡터 SP-2001
차단 ACE Serotec BUF029
비오틴 안티 - 마우스 IgG1 BD 553441
마우스 IgG1 K Isotype 제어 eBioscience 14-4714-85
10X TBS (생리 트리스 버퍼) Cellgro 46-012-CM 10xTBS 80 G / L NaCl 및 24.2 g / L Tirs을 포함,
세차를위한 ddH2O와 1X로 희석;
십대 초반 20 시그마 - 알드리치 P1379 한 ML은 TBST를 만들기 위해 1X TBS의 1 L에 추가
대상 검색, 20x Celerus 웨이브 014-3000-000 ddH 2 O로 1 회에 희석
190 증명 에틸 알코올 Pharmco - Aaper 111000190
200 증명 에틸 알코올 Pharmo - Aaper 111000200
크실렌 VWR 95057-827
Hematoxylin 리차드 - 앨런 과학 72,804
Cytoseal 60 리차드 - 앨런 과학 8310-4
Coverslips 코닝 2940-245
습도 챔버 시그마 H6644
표 1. 시약 및 장비.

참고문헌

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

항원 회복DAB 발색항체 염색조직 탈수현미경 분석신호 증폭
췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.