여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

요약

그린 몬스터 방법은 리포터 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질로 표시된 여러 삭제의 급속한 조립이 가능합니다. 이 방법은 반복 삭제의 성적 구색의 사이클 등 삭제를 들고 세포의 형광 기반의 강화를 통해 효모 변종 운전에 기반을두고 있습니다.

초록

유전자 삭제에 대한 Phenotypes은 종종 변이가 특정 유전 배경이나 환경 조건 ^1,2에서 테스트하는 경우에만 공개됩니다. 많은 유전자 숨겨진 유전자의 기능에게 ^{3,4 가면을 벗어 라하기} 삭제해야 예제가 있습니다. 중요한 발견의 가능성에도 불구하고, 세 개 이상 유전자를 포함한 유전자 상호 작용은 크게 미개척 있습니다. 다중 돌연변이의 상호 작용 철저한 검색의 삭제 가능한 조합의 깎아 지른듯한 숫자로 인해 비실용적 것입니다. 그러나, 이러한 일반적인 기능을 공유 큰 사전 기회로 paralogs 세트 등 유전자,의 선택한 세트의 연구 정보를 것입니다.

효모 Saccharomyces cerevisiae에서 유전자 녹아웃는 상동 재조합을 통해 선택 마커로 유전자를 대체하여 수행됩니다. 마커의 수가 제한되어 있기 때문에, 방법은 샘을 제거하고 재사용을 위해 개발 된 전자 표시 ^{5,6,7,8,9,10.} 시간이 생성 될 삭제의 수와 비늘 선형 필요하기 때문에 그러나, 이러한 방법을 사용하여 순차적으로 엔지니어링 여러 변이은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다.

여기 정기적으로 효모 ¹¹ 여러 삭제를 꾸민위한 그린 몬스터 방법을 설명합니다. 이 방법에서는, 삭제에 통합 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자는 각 변형에 포함 된 삭제의 수 (그림 1)에 따라 양적 라벨 긴장하는 데 사용됩니다. 효모 결합 및 세포의 감수 분열을 통해 GFP-표시의 삭제 구색의 반복 라운드는 긴장의 삭제의 축적 (그림 2)로 연결이 삭제 더 많은을 가진 변종의 흐름 cytometric 강화와 결합. , 라운드 당 하나 이상의 삭제를 통합하는 각 과정, 병렬로 여러 프로세스를 수행하면 변형 건설에 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. 내용이 "> 첫 번째 단계는 haploid 단일 돌연변이는 칭했다 준비하는 것입니다 'ProMonsters'를 GFP를 삭제 궤적에서 기자와 '툴킷'중 하나를 수행 각각의 loci을 하나 그린 몬스터 GMToolkit -이나 GMToolkit-α .. can1Δ 궤적 (그림 3) 효모 삭제 컬렉션 ^{12 일부터} 변종을 사용하여이 GFP-마크 삭제 편리하게 보편적 GFP을 통해 이러한 변종에 존재하는 일반적인 KanMX4 카세트 교체에 의해 생성 될 수있다 - URA3 조각을 각 GMToolkit에는 다음이 포함됩니다 중 - 또는 α-결합 형 특정 haploid 선택 마커 ^1과 정확히 두 GMToolkits이 존재 경우, 이하 diploids의 선택을 허용, 그런 두 마커 중 하나입니다.

두 번째 단계는 삭제 loci는 무작위 구색 및 / 또는 meiotic recomb하여 단일 세포 내에서 결합 할 수있는을 통해 성적 자전거를 수행하는 것입니다결합 및 sporulation의 각주기를 함께 ination.

프로토콜

1. ProMonsters의 생성

1. tetO ₂ GFP 마커와 순서와 프리 머를 사용하여 플라스미드 pYOGM012 (암피실린 저항)에서 URA3 마커를 증폭하여 보편적 인 GFP 교체 카세트 준비 :
   GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG 및 GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT (굵게 표시된 지역 타겟이 분명한 교체를 허용 KanMX4 카세트의 측면을 노릴 지역에 호몰 로지를 제공합니다). PCR 반응은 Phusion의 효소 HF 버퍼, 그리고 0.5 NG / μl의 템플릿 DNA 농도로 시작 3퍼센트 디메틸 sulfoxide (뉴 잉글랜드 BioLabs)를 수행해야합니다. PCR 프로그램은 98 10 초 30 초 및 98 ° C의 35주기위한 ° C, 49 ° 30 초에 C, 그리고 1.5 분 72 ° C입니다. 반응 볼륨 각 변환 실험에 충분한 DNA를 제공하기 위해> 50 μl해야합니다. 우리는 정화열 당 처리 PCR 반응 ~ 50 μl로 QIAquick PC....

결과

네 GFP-마크 삭제합니다 (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) 수행 - haploid 변형은 네 삭제를 수행 α-haploid 변형으로 건너되었을 때 (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), 두 삭제와 (ycl033cΔ yer042wΔ)은 두 변종이 대표에서 공유 결과는 얻은 것입니다. 짝짓기 혼합물은 diploids을 선택 G418 및 NAT를 포함하는 YPDA 매체에 배양되었다. 그 결과 diploids는 sporulation 매체에 배양 하였다. 포자는 zymolyase 치료와 sonication에 의해 분산, 그리고 haploid 선택 미디어에서 germinated되었습니다. 세포는 다음 GFP를 표현하도록 유도했다. 흐름 cytometer로 문을 사용하여 셀의 인구는 쓰레기 또는 셀 집계 (그림 5)를 포함 할 가능성이 있다는 선정되었습니다. 이 인구 내에서 세포의 가장 밝은 1퍼.......

토론

우리가 그린 몬스터 접근 방식을 개발로서, 우리는 게놈 다시 정리하기로 이어지는, 다른 GFP 교체 카세트 사이의 재조합의 가능성에 관심을했습니다. 이 가능성에 대한 완화하는 것은 성공적으로 결합하고 세포의 감수 분열의 여러 순찰을받은 세포에 대한 선택입니다. 재 배열 genomes을 간직한 세포는 동일한 다시 정리하기없이 셀에 결합 후 더 적합 할 것으로 예상됩니다. 사실, 우리는 GFP 카세트 ¹¹ 사이의 재조합에 의한 게놈 불안정성을 관찰 없습니다. 그러나, 우리는 완전히이 가능성을 제외 할 수 없습니다, 그래서 그것은 사용자가 다시 정리하기 위해 생성 된 변종을 테스트하는 것이 좋습니다. 펄스 - 필드 겔 전기 영동은 총 이상을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 삭제 내에서 시퀀스에 소둔 프리 머와 PCR은 야생 형 시퀀스의 부재를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.

설립 긴장, GF의 형광 수준에 따라P 강도는 채도가 한 16 삭제 ¹¹

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약이나 악기의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
G418	시그마 - 알드리치	A1720	(0.2-μm 필터) 물에 녹아 및 필터 - 소독. 주식 농도 : 200 밀리그램 / ML. 4 ° C.에 저장
ClonNAT (nourseothricin)	워너 BioAgents	5001000	(0.2-μm 필터) 물에 녹아 및 필터 - 소독. 주식 농도 : 100 밀리그램 / ML. 4 ° C.에 저장
Doxycycline	시그마 - 알드리치	D9891	(0.2-μm 필터) 50 % 에탄올에 용해 여과 - 소독. 주식 농도 : 10 밀리그램 / ML. 4 주마다 신선한하십시오. 4에 알루미늄 호일 및 매장을 사용하여 빛의 방패 ° C.
Zymolyase	ZymoResearch	E1005
Difco 효모 질소 기지 w / O 아미노산	BD	291940
권총 (튜브 용 회전하는 것)	Labnet	H5600
Enduro 젤 XL 전기 영동 장치	Labnet	E0160
Sonifier 450	브랜슨	101-063-198
Sonifier 450에 대한 Microtip	브랜슨	101-148-062
FACSAria 셀 정렬	BD
MoFlo 셀 정렬	Beckman - 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날
Biomek FX 또는 동급 로봇	Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날		선택 사항입니다. genotyping의 PCRs을 설정하십시오.