Summary

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

Published: August 17, 2012
doi:

Summary

Een<em> In vitro</em> Model voor genetische studie van regeneratie van axonen met gekweekte volwassen muis dorsale wortel ganglion neuronen wordt beschreven. De methode omvat een re-suspension/re-plating stap naar axon opnieuw groei mogelijk te maken van neuronen ondergaat genetische manipulatie. Deze aanpak is vooral handig voor verlies-van-functie studies van regeneratie van axonen met behulp van RNAi-gebaseerde proteïne knockdown.

Abstract

Het is algemeen bekend dat volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen niet hun axonen regenereren na blessures als gevolg van verminderde intrinsieke vermogen om axon groei en een vijandige omgeving in de volwassen CZS 1,2 ondersteunen. In tegenstelling tot volwassen neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS) gemakkelijk te regenereren na blessures 3. Volwassen dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen zijn goed bekend bij krachtig regenereren na perifere zenuwletsels. Elke DRG neuronen groeit een axon van de cel soma, met vestigingen in twee axonale bedrijfstakken: een perifere tak innerveren perifere doelen en een centrale vestiging zich uitstrekt tot in het ruggenmerg. Letsel van de DRG perifere axonen resulteert in een aanzienlijke regeneratie van axonen, dat de door centrale axonen in het ruggenmerg slecht regenereren na het letsel. Echter, als de perifere axonale schade optreedt voorafgaand aan het ruggenmerg (een proces genaamd de conditionering laesie), regeneratie van het centrum van axonen is greatly verbeterd 4. Bovendien is de centrale axonen van DRG neuronen dezelfde vijandige omgeving als dalende corticospinale axonen in het ruggenmerg. Samen, wordt verondersteld dat de moleculaire mechanismen die regeneratie van axonen van de volwassen DRG neuronen kan worden aangewend om CNS regeneratie van axonen te verbeteren. Als gevolg daarvan zijn volwassen DRG neuronen nu op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om te studeren regeneratieve axon groei van 5-7.

Hier beschrijven een werkwijze voor volwassenen DRG neuron cultuur kan worden gebruikt voor genetische studie van axon regeneratie in vitro. In dit model volwassen DRG neuronen zijn genetisch gemanipuleerd via elektroporatie-gemedieerde gen transfectie 6,8. Door transfecteren neuronen met DNA-plasmide of Si / shRNA, deze aanpak maakt zowel winst-en verlies-van-functie experimenten om te onderzoeken de rol van elk gen-of-interest in axon groei van volwassen DRG neuronen. Wanneer neuronen worden getransfecteerd met si / shRNA, de beoogde endogene eiwit ismeestal leeg is na het 3-4 dagen in cultuur, gedurende welke tijd robuuste axongroei al heeft plaatsgevonden, waardoor de verlies-van-functie studies minder effectief. Als oplossing voor dit probleem beschreven methode omvat een resuspensie en opnieuw uitplaten stap na transfectie, waardoor axons opnieuw groeien neuronen in afwezigheid van de gerichte eiwit. Tot slot geven we een voorbeeld van het gebruik van deze in vitro model om de rol van een axon regeneratie-geassocieerde gen, c-Jun, studeren in het bemiddelen axon groei van volwassen DRG neuronen 9.

Protocol

1. Voorbereiding van Dekglaasjes, kweekmedium, en Spijsvertering Enzymen De 12 mm rond nr.1 dekglaasjes worden gebruikt voor het neuronale cultuur. De dekglaasjes worden gereinigd met 10% HCl gevolgd door overnacht ultrasone wassen met gedestilleerd en gedeïoniseerd water 3 keer (20 min / uur). De gereinigde dekglaasjes worden opgeslagen in 70% ethanol voor toekomstig gebruik. Voor elke experimenten, de dekglaasjes worden de lucht gedroogd en geplaatst in de cultuur plaat. Om de gedroogde laag dekg…

Discussion

Volwassen DRG neuronen hun axonen regenereren robuust na perifere zenuwschade in vivo en in vitro, en zo een nuttig systeem om regeneratie van axonen studie bij volwassen dieren. In vitro cultuur van volwassen DRG neuronen wordt steeds een veel gebruikte methode om de moleculaire mechanismen te onderzoeken waardoor regeneratie van axonen wordt geregeld. De in vitro procedure van het kweken van volwassen muis DRG neuronen die hier in staat stelt snel en doeltreffend genetische studie v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door subsidies te FZ uit NIH (R01NS064288) en de Craig H. Neilsen Foundation.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
MEM Invitrogen 11090-081
Poly-D-Lysine hydrobromide Sigma -Aldrich P6407
Laminin Invitrogen 23017-015
5-fluoro-2-deoxyuridine Sigma -Aldrich F0503
Uridine Sigma -Aldrich U3003
Collagenase A Roche 10103578001
TrypLE Express Invitrogen 12604-013
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098
Penicillin-streptomycin (100X) Invitrogen 15140-122
GlutaMAX-I (100X) Invitrogen 35050-038
Glass coverslips (#1) Electron Microscopy sciences 72196-12
24 well cell culture plate Becton Dickinson 35-3047
1X PBS Mediatech 21-040-CV
Sterile, distilled and deionized water Mediatech 25-055-CV
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons Lonza VPG-1001
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun Dharmacon L-043776
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) Covance MMS-435P
ProLong Gold Antifade mounting solution Invitrogen P36930

References

  1. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  2. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
  3. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
  4. Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
  5. Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
  6. Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
  7. Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
  8. Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
  9. Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
  10. Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
  11. Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
  12. Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).

Play Video

Cite This Article
Saijilafu, Zhou, F. Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (66), e4141, doi:10.3791/4141 (2012).

View Video