phagokinetic 운동성 트랙 분석은 세포의 움직임을 평가하는 데 사용되는 방법입니다. 특히, 분석은 양적 방식으로 시간이 지남에 chemokinesis (임의의 셀 운동성)을 측정합니다. 검정은 콜로이드 골드 코팅 coverslips에 미치는 운동의 측정 트랙을 만들 수있는 세포의 능력을 활용합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 운동성은 단세포 및 다세포 생물 모두에게 중요한 생물학적 과정입니다. 그것은 영양소 나 거리에 적합 조건뿐 아니라 조직 개발, 면역 감시 및 상처 치유에 대한 다세포 생물에서와 같이, 단 몇 역할을 하나, 둘, 셋을 언급하는의 근원에 대한 단세포 생물의 움직임에 필수적입니다. 이 과정의 규제 완화는 심각한, 신경 심혈관 및 면역 질환뿐만 아니라 악화 종양 형성으로 이어질와 4,5 확산 될 수 있습니다. Molecularly, 고를 중합 및 수용체 재활용이 셀 6,7,8의 전진 운동을 유도 세포의 확장 (lamellipodia)를 만드는 중요한 역할을 재생 표시되어 있습니다. 그러나, 세포 마이그레이션하는 것에 대한 많은 생물 질문받지 않은 남아 있습니다.
인간의 건강과 질병의 세포 운동성의 중심 역할은 특정 멕을 이해의 중요성을 강조hanisms이 과정에 참여, 특히 중요한 세포 운동성을 평가하는 정확한 방법을합니다. 현미경은 일반적으로 세포의 움직임을 시각화하는 데 사용됩니다. 그러나, 세포는 운동성 세포의 정량 시간이 실효 영화를 만들 고가의 카메라와 소프트웨어를 필요로하는 리소스를 소모 과정을 세포 이주의 양적 측정을, 오히려 천천히 이동합니다. 따라서, 비용 효율적인 비 힘드는, 그 일반적인 실험실 장비를 활용합니다 세포 이주의 양적 측정을 수행 할 수있는 능력은 많은 연구자를위한 훌륭한 필요합니다.
phagokinetic 트랙 운동성 분석은 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslip 9,10에 측정 트랙을 만들 수는 경로에서 금 입자를 삭제하는 이동 셀의 능력을 활용합니다. 자유롭게 사용할 소프트웨어의 사용으로 여러 트랙이 통계 요구 사항을 달성하기 위해 각 치료를 평가 할 수 있습니다. 검정은 평가하기 위해 활용 될 수있다이러한 암 세포 11,12, 섬유 아세포 9, 호중구 13, 골격근 세포 14, keratinocytes 15, trophoblasts 16, 내피 세포 17와 단핵 세포 10,18-22 많은 세포 유형의 운동성. 프로토콜은 나트륨 구연산의 chloroauric 산 (호주 3 +)의 감소에 의해 생성 된 금 나노 입자 (호주 °)으로 코팅 슬라이드의 생성을 포함한다. 이 방법은 1951 23인치 Turkevich 외에 의해 개발 된 후 Frens 외하여 1970 년대 향상되었습니다. 24,25. 이 화학 감소 단계의 결과로, 금 입자 (직경 10-20 nm 정도)는 반응 혼합물로부터 침전 및 셀룰러 마이그레이션 분석 9,26,27에서 사용하기위한 다음 준비가되어 유리 coverslips에 적용 할 수 있습니다.
일반적으로 phagokinetic 트랙 운동성 분석 세포 운동성의, 빠른 양적 쉽게 측정하기위한 한 방법입니다. 또한,시간이 실효 영상뿐만 아니라 연구자의 필요에 따라 다른 용도 의무가없는 세포 유형에 사용할 수 있도록 간단한 높은 처리량 분석으로 활용 될 수있다. 함께 양적 비싼 현미경 및 소프트웨어 필요없이 여러 세포 유형의 세포 운동성을 측정 할 수있는 능력은 일반적인 실험실 장비와 화학 물질의 사용과 함께, 휴대을 이해 phagokinetic 트랙 운동성 분석에게 관심이있는 과학자를위한 견고한 선택을 운동성.
프로토콜
1. 젤리 - 코팅 Coverslips의 작성
- 멸균 플라스틱 100mm 요리 (ES)의 장소 산 세척 유리 coverslips (직경 15mm). 요리 당 8-9 coverslips을 놓고 서로가 서로를 만지거나 요리의 측면 있지 않은지 확인 ...
참고 : Coverslips, 바늘과 핀셋이 가능한 오염 미생물뿐만 아니라, 운동성 등의 세포 기능에 영향을 미칠 것입니다 endotoxins을 제거 할 무균 있어야합니다.
- 젤라틴 가루를 무게 0.5 g/300 ML의 최종 농도와 젤라틴 솔루션을 만들기 위해 탈 이온수의 분말을 resuspend. 다음, 젤라틴 솔루션은 autoclaved해야합니다.
- 피펫 2-3 각 coverslip에 젤라틴 (~ 100-150 ML)로 떨어.
참고 : 젤라틴은 접시를 터치하거나 요리에서 coverslips을 제거 할 수 없습니다 허용하지 않도록주의하십시오.
- 10 분 동안 90 ° C에서 오븐에 100mm 요리에 젤라틴 코팅 coverslips을 구워.
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결과
표시는 하나의 셀 (우리의 실험에서 단핵 세포는 그림 2에 표시되어 있습니다)에 의해 삭제 트랙 영역을 표시하는 가벼운 현미경으로 촬영 한 사진의 예입니다. 비 운동성 세포는 특성 작고, 타원형 또는 이들 unstimulated 세포 (그림 2A와 2B)에 대한 운동의 낮은 기저 수준을 나타내는 스스로 주위에 원 모양의 책자를 만들 수 있습니다. 반면, 높은 운동성 세포 [시스템에서 인간 사이토 메갈로 바이러스 (HCMV)에 감염된 세포는] 가늘고 긴 트랙 영역으로 그림 2C와 2D를에 표시된 방향 움직임을 특징으로하고 있습니다. 40x 목적으로 역 현미경을 사용하여 트랙 영역의 여러 사진을 취득 후, 총 트랙 영역은 ImageJ 소프트웨어 (그림 3)를 사용하여 표시했습니다, 유사한 결과는 다른 소프트웨어 응용 프로그램과 함께 얻을 수 있습니다. 는 무료이며 사용하기 쉽게 때.......
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토론
이 문서에서 제시 phagokinetic 트랙 운동성 분석은 세포 이주의 정량 분석을위한 간단하고 매우 효과적인 방법입니다. 여러 셀 타입은 9-17을 분석 할 수 있기 때문에,이 방법은 여러 분야에 걸쳐 잠재적 인 폭 넓은 사용이 있습니다. 콜로이드 골드 코팅 유리 coverslips의 사용은 움직이는 세포에 의해 삭제 트랙 영역의 측정 할 수 있습니다. 검정은 세포 운동성에 (ECM의 리간드, 바이러스, 박테리아를 정화 즉, 성장 요소) 다른 자극의 효과를 측정 할 수 있습니다. 또한, 셀 고정에 대한 요구의 부족은 다른 실험 시간 지점에서 세포 마이그레이션 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 분석은 표준 광 현미경, CCD (전하 결합 소자) 이미지 센서와 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 표준 카메라가 필요합니다. 따라서 정교한 현미경과 카메라가 필요하거나 특별한 소프트웨어 스위트 아르되지 않습니다. 비록 엉덩이에불안은 디자인 간단하다, 그것은 통계적으로 실험 조건의 다양한.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원 (AI050677, HD-051998, 그리고 GM103433), 말콤 Feist 심장 혈관 연구 교제, 그리고 미국 심장 협회 predoctoral 휄로 십 (10PRE4200007)에서 보조금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 유리 Coverslips (15 ㎜) | 피셔 과학 | 12-545-83 | |
| 젤라틴 300 블룸 | 시그마 - 알드리치 | G-1890 | |
| Tetrachloroauric 산성 Trihydrate | 피셔 화학 | G54-1 | 14.5 ㎜ (최종 작업 솔루션) |
| 나트륨 시트르산 | 피셔 과학 | BP327-500 | 0.5 % (최종 작업 솔루션) |
| Paraformaldehyde | 피셔 과학 | O4042 | 3퍼센트 (최종 작업 솔루션) |
| 100mm 조직 문화 요리 | Sarstedt | 83.1802 | |
| 12 자 플레이트 | 피셔 과학 | 08-772-29 | |
| 24 자 플레이트 | 피셔 과학 | 07-200-84 | |
| Techne 오븐 Hybridiser HB-1D | LabPlanet | 2040500 | 표준 실험실 오븐은 충분 |
| 10 ML 혈청 학적 피펫 | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipet-보조 필러 / 디스펜서 | Drummond | 13-681-15 | |
| P200 단일 채널 수동 피펫 | 비가 | PR-200 | |
| 200 ML 장벽 팁 | CLP | BT200 | |
| ImageJ 소프트웨어 | httP :/ / rsb.info.nih.gov / 엘 제이 / | 라이센스 : 공개 도메인 | |
| photometrics CoolSNAPfx과 니콘 이클립스 TE300은 12 비트 CCD 카메라를 흑백 | 니콘 | 중단, 가장 유사한 사양은 니콘 이클립스 티를 가지고 있지만, 낮은 엔드 니콘 80i도 적합합니다. 다른 브랜드도 비교 현미경을 제공합니다. | |
| 참고 : 아래에 나열된 시약 및 장비는 다양한 연구에서 우리가 이용되었습니다. 다른 공급, 공급 업체, 시약 및 장비 등의 손님들이 유사한 사양을 가지고, 사용할 수 있습니다. |
참고문헌
- Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
- Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
- Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J.
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