Method Article

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

DOI:

10.3791/4209

⸱

January 27th, 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Vanderbilt University School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, Vanderbilt University School of Medicine, 3Vanderbilt Institute of Chemical Biology, Vanderbilt University School of Medicine

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

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Formal Correction: Erratum: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels
Posted by JoVE Editors on 10/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels. The Protocol section has been updated.

The formula in step 7.1 of the Protocol has been updated from:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp + meann |

to:

Z prime = 1- (3SDp + 3SDn)/|meanp - meann |

Summary

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안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 높은 처리량 화합물 심사에 대한 채널의 활동을 측정하기위한 양적 형광 분석을 개발하고 검증하기위한 방법이 제공됩니다.

Abstract

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안쪽 정류기의 칼륨 (Kir) 채널 가족의 특정 구성원은 고혈압, 심방 세동과 통증 1,2 등의 질환의 다양한에 대한 약물 목표를 postulated 있습니다. 대부분의 경우, 그러나, 자신의 치료 가능성이나 기본적인 생리 기능을 이해하는 방향으로 진행 좋은 약리 도구의 부족에 의해 느려졌습니다. 사실, 안쪽 정류기 제품군의 분자 약리학 훨씬 nanomolar 화성과 매우 선택적 펩타이드 독소의 변조기의 번호가 3 발견되었습니다 된 전압 개폐 칼륨 (KV) 채널의 S4 superfamily의 뒤에 느껴지있다. 벌 독이 독소의 tertiapin 및 파생 4,5 Kir1.1와 Kir3 채널의 강력한 억제제하지만, 펩티드는 실험적으로 therapeutically뿐만 아니라 제한된 용도의 antigenic 속성과 가난한 생체 이용률, 신진 대사 안정성과 조직 penetrance로 인해 수 있습니다. 강력한 개발향상된 약리 특성을 가진 선택적 작은 분자 프로브는 완전히 생리학과 Kir 채널 치료 가능성을 이해하는 열쇠가 될 것이다.

학술 과학자들은 더 나은 약리학 6 필요로하는 분자 표적 및 신호 전달 경로에 대한 프로브 발견 캠페인을 시작하기 위해 국립 보건원에서 지원하는 분자 도서관 프로브 제작 센터 네트워크 (MLPCN (주) NIH) 공통 기금은 기회를 만들었습니다. MLPCN는 연구자에게 산업 규모 검진 센터, 의약 화학, 정보학은 유전자와 유전자 네트워크의 기능을 명료하게하다하는 작은 분자 프로브를 개발 지원에 대한 액세스를 제공합니다. MLPCN에 항목을 얻을의 중요한 단계는 높은 처리량 검사 (HTS)에 대한 의무입니다 강력한 대상 또는 경로 별 분석의 개발입니다.

여기, 우리는 형광 기반의 탈륨 (TL +) 자속 assa을 개발하는 방법에 대해 설명합니다높은 처리량 화합물 심사 7,8,9,10에 대한 Kir 채널 기능의 y는. 분석은 K의 투자율 + K + congener TL +에 채널 기공을 기반으로합니다. 상업적으로 이용 가능한 형광 TL + 기자 염료가 모공을 통해 TL의 transmembrane 유량을 + 감지하는 데 사용됩니다. BTC, FluoZin-2 및 FluxOR 7,8 : TL + 자속 assays에 적합 적어도 세 상업적으로 이용 가능한 염료가 있습니다. 이 프로토콜은 FluoZin-2를 사용하여 분석 개발에 대해 설명합니다. 원래 개발 및 아연 표시로 판매했지만, FluoZin-2 전시 TL시 형광 방출 + 바인딩에 강력하고 복용 종속적 인 증가합니다. 우리는 FluxOR는 7,8 사용할 수 등 9,10 할 계속하기 전에 FluoZin-2와 협력하기 시작했습니다. 그러나, 분석 개발 단계는 세 염료에 본질적으로 동일하며, 사용자는 자신의 특정 N에 가장 적합한 어떤 염료 확인해야합니다eeds. 우리는 또한 MLPCN에 항목으로 간주 할 수에 도달해야합니다 검정의 성능 벤치 마크에 대해 설명합니다. TL +는 쉽게 대부분의 K + 채널을 permeates 때문에, 분석은 대부분의 K + 채널 대상에 적용해야합니다.

Protocol

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1. 안정적인 Polyclonal 세포 라인의 생성

  1. 관심 Kir 채널을 표현하는 고품질의 안정적인 세포 라인의 설립은 강력한 높은 처리량 검사 분석을 개발 대한 중요한 첫 걸음입니다. 제정 K + 채널 overexpression은 셀 사망 경로, 안정적인 세포 라인 변성 및 분석 성능의 손실의 활성화로 이어질 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 문제를 방지하고 분석 개발을위한 편리한 내부 통제 (아래 참조)를 제공하기 위해 테트라 사이클린-inducible 표현 시스템은 8을 권장합니다.
  2. 문화 부모의 T-렉스 - HEK293 B-중간 (DMEM 성장 매체 10 % FBS, 50 U / ML 페니실린, 50 μg / ML 스트렙토 마이신, 5 μg / ML Blasticidin S를 포함)에 표준 기술을 사용하여 셀. transfection하고 안정적인 클론 선택에 대한 초기 통로 세포를 (액체 질소 저장에서 해동부터 예 3-4 통로)를 사용하십시오.
  3. 의 플레이트 4000000 T-렉스 - HEK293 세포75cm 2 플라스크 그래서 술병은 약 80 % 합류 다음 날입니다. 37 번 5 % CO 2 인큐베이터에서 밤 문화 ° C.
  4. ....

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Results

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테트라 사이클린-inducible 표현 시스템의 사용은 내생 경로와 관심 Kir 채널을 통해 TL + 자속을 구별하기에 편리한 내부 통제를 제공합니다. 그림 1 쇼 실험의 다른 유형에 사용되는 셀 도금지도의 예. uninduced 또는 테트라 사이클린 - 유도 세포를 포함하는 우물의 위치는 서로 다른 색상으로 표시됩니다. 그림 2A는 분석 개발과 화합물 심사에 대한 최적의 TL + 농도를 결정하는 데 사용되는 소스 판지도를 보여줍니다. 색상 그라디언트는 100 %에서 0.002 % TL에 이르기까지 3 배 희석 시리즈를 나타냅니다 +. 대표 형광 강도의지도는 + 플럭스 값은 각각 낮은 - 투 - 높은 TL을 나타내는 멋진 - 투 - 따뜻한 색상으로, 그림 2B에 표시됩니다. 그림 1C에 표시된 셀 도금 맵이 실험에 사용되었다. t.......

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Discussion

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데이터 치료 : 일단 데이터가 분석에 일반적인 단계는 실험, F 0 초에 초기 값으로 각도의 형광 반응, F를 정규화, 포함한다 수집하고 있습니다. 이것은 일반적으로 "정적 비율"로 지칭하고 "F / F 0"상징합니다. F 0 표시기 염료에 의해 ​​지배되는 경우에는 정적 비율 작업이 실질적으로 같은 조명, 신호 컬렉션에 disuniformities 등 여러 요인에 대한 해결됩니다 그리고 핸드폰 번호. 배경이 적절하게 고정 비율을 계산 이전에 처리 할 수​​ 있습니다하지 않는 한 염료 신호가 약한 또는 시스템의 배경 형광 또는 반사가 높은 경우, 정적 비율은 적용되지 않습니다. 데이터 정규화 후 활동을 수량화하고 조회를 선택하는 데 사용됩니다 하나의 값으로 형광 파형을 줄이기 위해 일반적입니다. 가장 일반적으로이 문제는 데이터를 맞는하여 수행됩니다TL의 추가 + e.......

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Disclosures

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 건강 보조금 1R21NS073097-01과 1R01DK082884 (JSD)과 국립 연구소 부여 PIER11VCTR에 대한 재단의 국립 연구소에서 자금에 의해 지원되었다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
pcDNA5/TO Invitrogen V1033-20 테트라 사이클린-inducible 표현 벡터
T-렉스 - HEK293 세포 Invitrogen R71007 테트라 사이클린-inducible 세포 라인
Lipofectamine LTX / 플러스 시약 Invitrogen 15338100 Transfection 시약
FBS 애틀랜타 체액 S11550 세포 배양 미디어
DMEM Invitrogen 11,965 세포 배양 미디어
Hygromycin B Invitrogen 10687-010 세포 배양 미디어
Blasticidin S Invitrogen R210-01 세포 배양 미디어
페니실린 / 스트렙토 마이신 Invitrogen 15,140 세포 배양 미디어
무료 HBSS - 이가의 Mediatech 21022CV 셀 세척
트립신 - 0.25 % Mediatech 25053CI 세포 분리
테트라 사이클린-HCL 시그마 T9823 유도 시약
Dialyzed FBS 애틀랜타 체액 S12650 도금 미디어
FluoZin-2 Invitrogen F24189 형광 염료
Pluronic F-127 Invitrogen P-3000MP 염료로드
HBSS Invitrogen 14,175 검정 버퍼
HEPES Invitrogen 15,630 검정 버퍼
NaHCO 3 시그마 S6297 TL + 자극 버퍼
MgSO 4 시그마 M2643 TL + 자극 버퍼
카소 4 • 2H 2 O 시그마 C3771 TL + 자극 버퍼
D-포도당 시그마 G7528 TL + 자극 버퍼
탈륨 황산 올드리치 204625 TL + 자극 버퍼
HEPES 시그마 H4034 TL + 자극 버퍼
DMSO 시그마 D4540 용제
여덟 채널 전자 pipettor Biohit E300 384에서 셀 도금 -잘 접시
BD PureCoat 아민 - 코팅 384 잘 접시 BD Biosciences 356719 검정 microplates
에코는 384 자 폴리 프로필렌 microplate (384PP)를 자격 Labcyte P-05525 합성 소스 microplates
384도 폴리 프로필렌 microplates Greiner 바이오 하나 781280
Multidrop 콤비 시약 디스펜서 열 과학 5840300
ELx405 microplate 와셔 BioTek ELx405HT 자동 셀 세척
액체 처리기를 반향 Labcyte Labcyte 에코 550
브라보, 자동화 된 액체 처리 플랫폼 애질런트 테크놀로지스 표준 모델
Hamama츠 FDSS 6000 하마 마츠 운동 이미징 플레이트 판독기

표 1. 재료 및 시약의 목록입니다.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ehrlich, J. R. Inward rectifier potassium currents as a target for atrial fibrillation therapy. J. Cardiovasc. Pharmacol. 52 (2), 129(2008).
  2. Bhave, G., Lonergan, D., Chauder, B. A., Denton, J. S. Small-molecule modulato....

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Inward Rectifier Potassium ChannelsThallium Flux AssayHigh throughput ScreeningFluorescent Tl Reporter DyeFluoZin 2Tetracycline Inducible Cells384 Well PlateZ Prime CalculationFluorescence Plate ReaderSmall molecule Modulators

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