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방법 논문

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

16.9K 조회수

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DOI:

10.3791/4235

⸱

2012년 11월 5일

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1Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine , 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine , 3Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, 4Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine , 5Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine , 6Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine , 7Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine , 8Michael E. DeBakey VA Medical Center

이 논문에서

요약

우리는 유전자 비 바이러스를 사용하여 transgene과 기본 인간의 T 세포를 수정하는 방법을 설명 piggyBac transposon 시스템입니다. T 세포는를 사용하여 수정 piggyBac transposon 시스템 전시 안정적인 transgene 표현.

초록

piggyBac transposon 시스템은 원래 양배추 자벌레 나방의 1,2에서 파생, 자연적으로 활성화됩니다. 이 비 바이러스 시스템은 가장 일반적으로 하나가 piggyBac transposase 효소 및 유전자 전달 활동에 필요한 역 반복 요소 사이에 관심의 유전자를 (들) 숨겨 플라스미드 transposon을 표현으로 두 plasmids을 활용, 기반 플라스미드입니다. PiggyBac의 mediates 유전자 전송을 통해 transposase 관심의 대상 셀 (들)의 게놈에 transposon 세그먼트를 통합된다 "잘라 내기 및 붙여 넣기"메커니즘이 있습니다. PiggyBac 3-5 포유류의 곤충 1,2의 다양한 효율적인 유전자 전달 활동을 시연하고있다 7,8 차 인간의 T 세포를 포함 cells6 인간. 최근 활동적인 piggyBac의 transposase는 유전자 전달 효율을 향상 9,10 생성되었습니다.

인간 T 림프구는 임상 intere의 역할암 (11)의 입양 immunotherapy에 대한 ST. 참고 중, 잠자는 숲속의 미녀의 transposon 시스템을 사용하여 인간의 T 세포의 transposon 수정을 포함한 첫 번째 임상 실험은 12을 승인했습니다. 우리는 이전에 인간의 T 세포의 유전자 변형에 대한 비 바이러스 성 방법으로 piggyBac의 유틸리티를 평가하고 있습니다. 우리는 리포터 유전자와 비 immunogenic inducible 자살 유전자 7 인간의 T 세포의 유전자 변형에 효율이 piggyBac 발견했다. 게놈 통합 사이트의 분석은 13로 또는 알려진 proto-oncogenes 근처 통합 환경의 부족을 공개했다. 우리는 종양 항원 HER2에 대한 감독 키메라 항원 수용체를 수행하는 유전자 - 수정 세포 독성 T 림프구에 piggyBac 사용하고, 유전자 수정 된 T 세포가 orthotopic 마우스 모델에서 체외 및 생체 내 HER2-양성 종양 세포의 살인을 대상으로 중재 것을 발견 14. 우리는 또한 piggyBac을 사용한rapamycin은 15 활용 암 치료에 도움이 될 것 rapamycin에 강한 인간의 T 세포를 생성 할 수 있습니다.

여기, 우리는 유 전적으로 인간의 기본 T 세포를 수정 piggyBac을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 문화, 유전자 수정, 및 T 세포의 활성화에 이어 인간의 피에서 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연을 포함하고 있습니다. 이 보고서의 목적을 위해, T 세포는 유동 세포 계측법에 의한 유전자 발현의 분석 및 정량화를위한​​ 리포터 유전자 (eGFP)로 수정되었습니다.

PiggyBac는 관심 유전자의 다양한 인간의 T 세포를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 종양 항원 14 T 세포를 직접 할 수 piggyBac 사용했지만, 우리는 또한 7 필요한 경우 유전자 변형 세포를 제거하기 위해 inducible 안전 스위치를 추가 할 수 piggyBac 사용했습니다. piggyBac의 대형화물 용량은 유전자 전송을 사용하고 있습니다큰 rapamycin의 방지를 mTOR 분자 (15 KB) 15. 따라서, 우리는 목적으로 다양한 종류의에 대한 일차적 인간의 T 세포의 안정적인 유전자 변형에 대한 비 바이러스 방법론을 제시한다.

프로토콜

일 0

1. 인간의 피에서 PBMCs의 절연

  1. 오세영 - 헤파린 vacutainer 튜브에 venipuncture를 사용하여 신선한 인간의 피 20 ML를 수집합니다.
  2. 믹스의 피와 1시 1분의 고급 RPMI 1640 (V / V) 비율입니다.
  3. 50 ML의 원심 분리기 튜브 (25 ° C) 20 ML lymphoprep 매체를 추가 할 수 있습니다. lymphoprep 상단에 혈액 RPMI 1640 믹스 천천히 층 25-30 ML.
  4. 브레이크없이 40 분 400 XG에 원심 분리기.
  5. 1X PBS (25 ° C)의 10 ML에 일회용 피펫을 사용하여 독특하고 퍼지 레이어를 모두 수집하고 1X PBS있는 50 ML에 볼륨을 가져.
  6. 10 분에 450 XG에 원심 분리기.
  7. 완전히 표면에 뜨는을 대기음 및 고급 RPMI 1640의 20 ML를 추가합니다.
  8. 5 분 400 XG에 원심 분리기.
  9. 표면에 뜨는을 대기음. 5 NG / ML rhIL-15과 보충 완전한 T 세포 미디어 10 ML를 추가 37 ° C.에 prewarmed
  10. 24 잘 조직 문화 코트에서 세포와 판의 수를 카운트/ 잘 완전한 T 세포 미디어 2 X 10 6 세포에서 에드 판은 5 NG / ML rhIL-15는 주변 우물에 멸균 물을 추가로 보충. 37 humidified 인큐베이터에서 하루 아침에 길러 ° C, 5 % CO 2.

1 일

2. T 세포를 자극을위한 안티 CD28 및 안티 3 번 CD 항체로 코팅 플레이트

  1. 1 μg / ML 각각의 농도에서 살균 물에 안티 CD28 및 안티 3 번 CD 항체를 희석.
  2. 비 코팅 조직 문화 24 잘 플레이트의 5 표시 우물 500 μl 각 항체 솔루션을 추가합니다.
  3. 우물의 휴식 멸균 물을 추가합니다. 4 ° C 냉장고에서 수축 랩과 장소에 판을 넣어.

3. Unstimulated T 세포의 Nucleofection

  1. 37 번 Prewarm T 세포 미디어 ° C와 rhIL-15 5 NG / ML로 보충. Nucleofector 솔루션의 2.25 ML에 Nucleofector 보충 한 500 μl를 추가하여 완벽한 nucleofector 솔루션을 준비합니다.
  2. liquot 5 μg transposon (Zeo-PT-CMV-eGFP)와 1.5 ML의 microfuge 관 transposase (pCMV-piggyBac)의 각. 참고 :이 최적의 유전자 전달을위한 transposase와 transposon의 DNA 금액을 최적화하고 최소화하기 위해 필요할 수 있습니다 세포 독성. plasmids 요청에 의해 저자에서 얻을 수 있습니다.
  3. 50 ML 튜브에 24 잘 조직 배양 플레이트에서 수확 PBMCs. 셀의 개수를 계산합니다. 유동 세포 계측법 동안 제어 등의 사용이 X 10 6 세포를 저장합니다.
  4. 400 XG, 5 분에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 7-10 X 10 6 세포를 추가 표면에 뜨는 및 손가락 제스처 펠릿 대기음.
  5. 느슨하게 세포 펠렛에 대한 T 세포 완벽한 nucleofection 솔루션 100 μl를 추가합니다.
  6. plasmids를 포함하는 관에 솔루션 세포 혼합물을 추가합니다.
  7. nucleofection 큐벳의 맨 아래에 솔루션 휴대 플라스미드 혼합물을 추가합니다. 모든 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
  8. 프로를 사용하여 셀을 Nucleofectg U-014 (Unstimulated T 세포, 인간, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
  9. 즉시 큐벳에 rhIL-15 prewarmed 미디어 500 μl를 추가합니다. rhIL15과 prewarmed 미디어의 1.5 ML과 24 잘 접시의 우물에 세포를 전송합니다.
  10. 37 humidified 인큐베이터에서 하루 아침에 길러 ° C, 5 % CO 2.

2 일

4. T 세포의 특이 현상 자극

  1. 수확 셀 및 셀 번호를 결정합니다. GFP 양성 세포의 빈도를 결정하는 유동 세포 계측법 0.5 X 10 6 세포를 따로 설정합니다. 컨트롤로 비 transfected PBMCs을 사용합니다.
  2. 비 조직 배양 코팅 플레이트에서 CD3/28 항체 솔루션을 기음과 T 세포 미디어와 각 잘 씻어.
  3. 전체 CTL 미디어 ML 당 0.5 X 10 6 세포에서 nucleofected 세포를 Resuspend5 NG / ML rhIL-15 보충. 2.0 ML 이외의 조직 문화 판의 4 우물에 nucleofected 셀의 각을 추가합니다. 잘 5 일에 0.5 X 10 6 비 nucleofected 셀을 추가합니다.
  4. 37 humidified 인큐베이터에서 3 일 동안 배양 ° C, 5 % CO 2.

5 일

  1. 비 코팅 조직 문화 판에서 자극 T 세포를 수확.
  2. 0.7에서 24도 코팅 조직 배양 판에있는 셀을 카운트하고 replate X 10 5 NG / ML IL-15 6 세포 / T 세포 미디어 ML.주세요

7 일

7. 유전자 발현 분석

  1. 수확 세포와 반 인간 CD8 항체와 얼룩은 (또한 반에는 3 번 CD 및 안티 CD4를 사용할 수)와 %의 GFP 발현을위한 유동 세포 계측법을 분석합니다.

일 8 (선택 사항)

8. T 세포의 확장

  1. transfection 후 일 8 일, T 세포는 T에 replated 할 수 있습니다더 확장 16도 당 0.7 X 10 6 세포 밀도에 IL-15과 셀은 미디어.

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결과

유전자 리포터 유전자 (eGFP)와 인간의 T 림프구를 수정의 단계를 보여주는 도식은 그림 1에 표시됩니다. 이러한 plasmids은 작성자의 요청시 이용 가능합니다. 리포터 유전자 (eGFP)와 유전자 변형 인간 T 림프구의 단계를 보여주는 schemtic은도 2의 바바리 수 있습니다. 그것은 그들에게, 분할 확장하고 문화에 전파하게하기 위해 T 세포를 활성화 할 필요가 있습니다. 수정 인간의 T 세포는 이후 배양 및 일 1 일 7 일 유전자 발현에 대한 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 표시는 그림 3에서 한 기증자의 결과입니다. 셀 셀 퀘스트 소프트웨어를 사용하여 allophycocyanin (APC) 복합 항 CD8, 4 형광 신호에 대한 필터 세트가 마련되어 FACSCalibur에 의해 eGFP (transgene)와 APC 형광에 대한 분석 물들되었습니다 (...

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토론

여기에 설명 된 방법은 기본 인간 T 림프구의 안정적인 transgene의 수정이 가능합니다. 우리는 이전에 리포터 유전자 (4 개 이상의 주), 비 immunogenic 자살 유전자 입양 immunotherapy에 대한 키메라 항원 수용체를 (100 개 이상의 일), 표현하는 T 세포를 수정하는 piggyBac transposon 시스템의 사용을 테스트 한 그리고 면역 억제 약물 7,13-15에 대한 내성을 처리합니다. 입양 immunotherapy 및 기타 응용 프로그램을위한 T 세포의 비 바이러스 성 수정은 retroviral 전달보다 훨씬 저렴하기 때문에 더 많은 활용해야합니다. 새로운 활동적인 piggyBac 요소의 사용은 인간의 T 세포에게 9 수정 안정적인 transgene의 제조의 가능성이 높아집니다. 여기에 설명되지 않았지만, 하나는 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 안정적 transfected T 세포의 필요한 숫자를 얻을 수 있습니다...

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공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

SS는 TBMM 프로그램을 통해 그라드 교육 교부금에 HHMI 메드에 의해 부분적으로 지원됩니다. MHW는 재향 군인의 담당 부서에서 경력 개발 상 박사 부부 해롤드 M. Selzman의 관대 한 지원에 의해 부분적으로 지원됩니다. 이 작품은 NIH 림프종 포자 부여 P50CA126752와 NIH R01 DK093660에 의해 부분적으로 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트 (선택 사항)
Lympholyte Cedarlane CL5015
고급 RPMI 1640 LifeTechnologies 12633020
Hyclone 태아 소 혈청 피셔 과학 SH3008803
GlutaMAX-I의 보충 LifeTechnologies 35050-061
인간 IL-15 재조합 단백질 eBioscience 14-8159
EndoFree 플라스미드 맥시 키트 Qiagen 12,362
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S & NBSP;
인간 T 세포 Nucleofector 키트 Lonza VPA-1002
CD8-APC 남부 생명 공학 9536-11
안티 - 인간 3 번 CD eBioscience 16-0037-81
안티 - 인간 CD28 BD Pharmingen 555725
24 잘 조직 문화 치료 플레이트 BD 팔콘 353047
24 자 비 조직 문화 판을 치료 BD 팔콘 351147
전체 T 세포 미디어 구성
1X 고급 RPMI 1640
5 %의 열 Inactivated 태아 소 혈청
이 MM GlutamaxIM-I

참고문헌

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