우리는 플라즈마 / 혈청 수집 전혈로부터 게놈 DNA를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다. 혈장 수집 후, 압축 된 혈액은 일반적으로 삭제됩니다. 우리의 새로운 방법은 기존의 방법에 비해 상당한 개선을 대표하고 추가 혈액을 요청하지 않고, DNA와 단일 컬렉션에서 사용할 수있는 플라즈마를 만든다.
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이 논문에서
요약
초록
실험실 테스트는 혈액의 세포 또는 액체 부분에서 수행 할 수 있습니다. 다른 혈액 수집 관의 사용은 분석 할 수있는 혈액 (전혈, 혈장 또는 혈청)의 부분을 결정합니다. 인간 질환의 유전 적 기초를 공부에 관련된 연구소 게놈 / 유전자 분석을위한 DNA의 소스로 EDTA를 함유 vacutainer에서 수집 된 항 응고 전체 혈액에 의존하고 있습니다. 대부분의 임상 실험실 표현형 결과 조사의 첫 단계로 생화학 적, 혈청 학적 및 바이러스 검사를 실시하고 있기 때문에, 항 응고 혈액은 헤파린 함유 튜브 (플라즈마 튜브)에 수집됩니다. DNA와 플라즈마 게놈과 프로테옴 데이터 모두를 동시에 병렬 분석에 필요한 그러므로 때, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 헤파린 튜브 모두에서 혈액을 수집하는 것이 관례이다. 혈액은 하나의 튜브에 수집 혈장과 DNA 모두에 대한 소스 역할을 할 수 있다면, 그 방법은 기존의 마약을 발전 간주됩니다ODS. 혈장 추출 후 압축 혈액의 사용은 이렇게 처리 된 혈액 샘플의 양을 최소화하고 각 환자에서 필요한 샘플 수를 줄여, 게놈 DNA의 대체 소스를 나타냅니다. 이것은 궁극적 시간과 자원을 절약합니다.
혈장 단백질 보존 BD P100 혈액 수집 시스템은 인간의 혈액에서 더 나은 단백질 바이오 마커 발견 및 프로테오믹스 실험을 가능하게 혈액의 단백질 함량을 안정화하기 위해, 이전의 혈장 또는 혈청 수집 관 1 이상 개선 된 방법으로 만들어졌습니다. BD P100 관은 15.8 분무 건조 K2EDTA ㎖의 응고를 방지하고 혈장 단백질을 안정화하는 단백질 분해 효소 억제제의 동결 건조 독점 넓은 스펙트럼 칵테일이 포함되어 있습니다. 또한 원심 분리 후 혈장과 세포 펠렛 사이에 물리적 인 장벽을 제공하는 기계적 분리기를 포함한다. 몇 가지 방법이 응고 혈액 SA에서 DNA를 추출하기 위해 고안되었습니다mples 오래된 플라즈마 튜브에 2-4 모았습니다. 이 방법의 문제는 주로 튜브 (겔 구분) 내부 분리기의 종류와 관련된 응고 혈액을 복구하는 어려움, 단편화 또는 응고 분산의 불편과 분리 겔 응고 추출 방해 하였다.
우리는 새로운 BD P100 튜브에 그려진 혈액에서 게놈 DNA를 추출하고 정화 첫 번째 방법을 제시한다. 우리는 P100 튜브에서 EDTA 튜브에서 그에게 DNA 샘플의 품질을 비교합니다. 우리의 접근 방식은 간단하고 효율적입니다. ) 혈액 수집, 2 기계적 분리기와 자당의 조합을 사용하여 기계적 분리기의 제거 및을 1) 플라즈마 BD P100 (BD 진단, 스파크, MD, USA)의 사용이 관 : 그것은 다음과 같이 네 가지 주요 단계를 포함 멸균 클립 금속 걸이, 3) 백혈구, 4를 포함 버피 코트 층의 분리)에서 게놈 DNA의 분리일반 상업 DNA 추출 키트 또는 유사한 표준 프로토콜을 사용하는 버피 코트.
프로토콜
1. 시료 채취
- 적절한 동의와 개인의 혈액 샘플을 수집합니다. 각 개인에 대한, P100 튜브 (BD 진단, 프랭클린 호수, NY, USA)에 혈액의 4 ~ 5 ML을 그립니다. 비교를 위해 동시에 EDTA 튜브에 혈액을 수집합니다.
- BD P100 관은 15.8 ML 스프레이 건조 K2EDTA 응고를 방지하고 혈장 단백질을 안정화하는 단백질 분해 효소 억제제의 동결 건조 독점 넓은 스펙트럼 칵테일이 포함되어 있습니다. 또한 기계적 분리기가 포함되어 있습니다. 처리가 발생할 때까지 전체 혈액을 수집 한 후, 하룻밤에 60 분 동안 실온에서 모두 튜브를 유지합니다.
- 실온에서 15 분 동안 2천5백g에서 BD P100 튜브를 원심 분리기. 마이크로 원심 분리기 튜브에 기계적 분리 위에서 수집 된 플라즈마를 전송합니다.
- -80에서 분리 아래 압축 혈액을 포함, P100 튜브를 저장 ° C가 DNA 내선을 시작할 준비가 될 때까지raction.
P100 튜브의 혈액 (P100_DNA)에서 2.1
- P100 튜브 -80에 저장됩니다 ° C 혈장 추출 후. 3~4개월에서 5 분 (그림 1A)를위한 물을 욕조에 37 °에서....
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결과
DNA의 품질 평가 및 농도 측정
P100_DNAs의 수율 EDTA_DNAs (표 1과 2)에 비해 유의하게 낮았다. 그 280분의 260 비율 값으로 표시 DNA 순도 P100_DNA 및 EDTA_DNA 샘플 세트 (테이블 1과 2) 모두 비슷합니다. DNA의 품질은 샘플의 각 집합 일부 저하가 EDTA_DNA 샘플에서 볼 수 있지만, 같은 (그림 2) 빛 번짐으로 표시 내에서 비교적 균일 한 것입니다. 분해의 더 많은 징후를 보여 주었다 EDTA_DNAs도 감소 DNA 농도를 보였다.
유전자형
EDTA_DNAs 및 P100_DNAs 모두 유전자형 통화의 환율을 비교 하였다. 그들은 유사한 통화 요금이 나왔고 두 내부 HapMap 제어 DNA (표 3)을 비교.......
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토론
많은 인간의 질병은 유전 적 원인을 가지고 인간의 질병의 유전 기초를 탐구하는 것은 증가하고 고품질의 DNA를 요구한다. 유전자 연구에 사용 된 DNA의 가장 일반적인 소스는 전체 혈액 항응고제 있습니다. 대부분의 임상 실험실 표현형 결과 조사의 첫 단계로, 생화학 적 혈청 및 바이러스 검사를 실시하고 있기 때문에, 혈액은 종종 플라즈마 튜브에 수집됩니다. 플라즈마를 수집 한 후, 압축 된 혈액은 종종 무시됩니다. 따라서, DNA가 유전 연구 또는 테스트를 수행하기 위해 필요한 경우, 추가 채혈은 동일한 환자에서 필요합니다. 그것은 백혈구가 들어 있으므로 폐기 압축 혈액 DNA의 잠재적 인 소스를 나타냅니다. 따라서, 플라즈마 튜브의 압축 된 혈액을 사용하면 과잉 혈액을 그리거나 추가 혈액 환자를 호출 할 필요없이보다 효율적으로 수집 된 혈액 샘플을 사용하는 기회를 제공합니다.
예를 다양한 방법압축 또는 응고 된 혈액의 백혈구에서 요로 DNA는 6-10보고되었습니다........
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| BD P100 튜브 | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA 튜브 | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| 종이 클립 | 사무용품 | ||
| 15 ml 튜브 | Corning | 430052 | |
| 적혈구 (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| 인산완충생리식염수 (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml 마이크로튜브 | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| 비드 어레이 리더 (Bead array reader) | Illumina | NA | |
| GenomeStudio 소프트웨어 | Illumina | N/A |
참고문헌
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H.
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재인쇄 및 허가
