이 문서 하나가 모방 수있는가하는 방법을 설명합니다 생체내에서 개발 Drosophila 버섯 본문 예 생체내 문화 시스템.
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이 논문에서
요약
초록
우리는 전체 Drosophila의 두뇌의 전직 생체내의 culturing에 대한 방법을 설명합니다. 이것은 급성 pharmacological 개입과 세포 과정의 라이브 영상을 허용하여 세포 생물학 및 중앙 뇌 구조의 개발을 조사하는 만성 유전 조작에 대위법으로 사용할 수 있습니다. 기법의 예를 들어, 이전에 우리 실험실 1부터 작동은 이전에 인식되지 않는 subcellular 구획은 Drosophila 중앙 뇌의 axons의 axonal 및 somatodendritic 구획 사이에 놓여 있다고 나타났습니다. 축삭 초기 세그먼트 (AIS) 2로 언급이 구역의 개발은, 신경 세포 특정 cyclin 의존 키나제, Cdk5에 의존하는 유전자 표시되었다. 우리는 Cdk5 특정 pharmacological 억제제 roscovitine 및 olomoucine 3 야생 형 Drosophila 애벌레 두뇌의 전직 생체내 치료는 actin 조직의 급성 변화를 일으키는, 그리고 여기에 표시유전자 Cdk5 활동이 결여 돌연변이에서 본 변화를 모방 세포 표면 단백질 Fasciclin 2의 국산화 인치
전 생체내 문화 기술의 두 번째 예제는 배아 버섯 본문 (MB) 애벌레에서 어른으로 변태하는 동안 감마 뉴런의 연결을 리모델링을 위해 제공됩니다. 버섯 몸은 후각 학습과 파리 4 메모리의 중심지이며, 이러한 감마 뉴런은 성인 innervation 패턴 5를 확립하기 위해 나중 timepoint에 다시 확장 지점 그리고 pupal 개발 중에 axonal와 돌기 가지를 치다합니다. MB 중 이러한 뉴런의 가지치기는 ecdysone 수용체 지하 1 층 7 시에 연기, ecdysone, 스테로이드 호르몬에 의해 실행되는 메커니즘에 의해, neurite 지점 6 지방 변성을 통해 발생하는 것으로 표시되고, 그의 활동에 따라 좌우되어 ubiquitin-proteasome 시스템 6. 전직 생체내의 culturing 우리의 방법은 B 수e는 더욱 발달 리모델링의 메커니즘을 심문하기 위해 사용. 우리는 전 생체내 문화 환경에서, MB 중 감마 뉴런은 생체내에서 해당과 비슷한 시간 코스 발달 가지치기의 과정을 recapitulated 것으로 나타났습니다. 그것은 세포 변형에 레스터 저지하기 위해 조직을 explanting 전에 1.5 시간 번데기 형성 이후까지 기다려야하지만, 필수입니다; 문화에 거의 없거나 전혀없는 변태로 이끌어 pupariation가 시작될 동물의 해부. 따라서, 적절한 수정으로 전직 생체내 문화 접근법뿐만 아니라 중앙 뇌 생물학의 안정 상태 측면과 같은 역동적인 공부를 적용할 수 있습니다.
프로토콜
미디어 A. 준비
- 필터 - 살균 슈나이더의 Drosophila 미디어 10 % 태아 소 혈청과 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 함께 보완하여 완벽한 미디어를 준비합니다.
- 미디어는 매번 신선한 준비되어야한다. 또는 미리 냉동 미디어의 신선한 나누어지는 각 사용하기 전에 해동 수 있습니다.
- culturing에 앞서, 10 μg / ML의 인슐린과 미디어 2 μg / ML ecdysone를 추가합니다. 약물은 농축 주식으로 준비하고 작은 aliquots에 얼려되었다. 해동 aliquots는 refrozen 아니었다.
- 모든 작업 솔루션은 25 ° C.로 유지되어야
애벌레의 두뇌 Culturing
1. 애벌레 두뇌의 선택 및 해부
- 12mm Millicell의 세포 배양 삽입에 미디어 500 μl를 추가합니다. 해부하는 두뇌는 쉽게 immunostaining을 촉진하기 위하여 다음과 삽입에 배치됩니다.
- 해부 시계 유리에 준비한 미디어의 소량을 추가합니다.
- U, 작은 주걱 노래를 방황하고 셋째 instar의 애벌레를 데리러와 시계 유리에 배치합....
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토론
변이와 transgenes 표현을 포함한 조직 구조와 기능의 만성 유전자 조작은 일반적으로 구분하는 것은 매우 어려울 수 즉각적인 효과와 늦은 간접 결과의 조합을 생산하고 있습니다. 약리학과 유전 방식을 보완하는 것은 표현형 뒤에 시간 코스의 심문을 용이하게하실 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 Drosophila 10 spermatogenesis 동안 다른 cytoskeletal 구성 요소의 기여를 해부에 대한 강력한 접근 방식이었습니다. 현재의 예제에서, 우리는 Drosophila에서 AIS의 구조를 유지하는 Cdk5에 대한 영구적인 요구가있다는 것을 보여줄 수있다. 다른 실험에서 우리는 또한 약물을 사용하여 성공을 이뤄 냈습니다 그 단백질 kinases (imatinib), actin 중합 (cytochalasin, latrunculin 및 jasplakinolide)와 microtubules (vinblastine과 taxol)를 포함하여 대상 기타 세포 구.......
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공개 사항
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
감사의 글
우리는 원고에 대한 그들의 조언, 유용한 토론 및 의견을 저희 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 특히 우리가 개조 실험에서 culturing 위해 머리를 해부하기 전에 1.5 시간 APF 때까지 기다리는 것이 좋은 제안 마르타 코흐와 Bassem 하산을 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 공촛점 현미경의 사용을위한 NHGRI 이미징 시설을 감사드립니다. 이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램, NIH (Z01 NS003106)의 기초 신경 과학 프로그램에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 최종 농도 |
| 슈나이더의 Drosophila 미디어 | Invitrogen | 21720-024 | |
| 태아 소 혈청 (열-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | Invitrogen | 15140-122 | 1퍼센트 |
| 인슐린 | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | 시그마 - 올드 리치 | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | 시그마 - 올드 리치 | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | 시그마 - 올드 리치 | O0886 | 100μM |
| 정상 염소 혈청 | Invitrogen | 50062Z | 1퍼센트 |
| 소의 알부민 세럼 | 피셔 과학 | M9501 | 1퍼센트 |
| 포름 알데히드 | 시그마 - 올드 리치 | D4551 | 4퍼센트 |
| 트리톤-X 100 | 피셔 과학 | BP151 | 0.5 % |
| 인산염은 염분 버퍼 | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | 벡터 연구소 | H1000 | |
| Millicell 셀 문화 삽입물 | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish 잘 사 | 써모 과학 | 176,740 | |
| 뒤몽 # 5 포셉 | 파인 과학 도구 | 11251-20 | |
| 현미경 슬라이드 | 피셔 과학 | 12-544-7 | |
| 유리 커버 | 피셔 과학 | 12-548 - 5M |
참고문헌
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al.
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