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방법 논문

전체의 전의 생체내의 Culturing, 개발 Drosophila의 뇌는

12.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4270

⸱

2012년 7월 27일

 ,  , 
1National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD

이 논문에서

요약

이 문서 하나가 모방 수있는가하는 방법을 설명합니다 생체내에서 개발 Drosophila 버섯 본문 예 생체내 문화 시스템.

초록

우리는 전체 Drosophila의 두뇌의 전직 생체내의 culturing에 대한 방법을 설명합니다. 이것은 급성 pharmacological 개입과 세포 과정의 라이브 영상을 허용하여 세포 생물학 및 중앙 뇌 구조의 개발을 조사하는 만성 유전 조작에 대위법으로 사용할 수 있습니다. 기법의 예를 들어, 이전에 우리 실험실 1부터 작동은 이전에 인식되지 않는 subcellular 구획은 Drosophila 중앙 뇌의 axons의 axonal 및 somatodendritic 구획 사이에 놓여 있다고 나타났습니다. 축삭 초기 세그먼트 (AIS) 2로 언급이 구역의 개발은, 신경 세포 특정 cyclin 의존 키나제, Cdk5에 의존하는 유전자 표시되었다. 우리는 Cdk5 특정 pharmacological 억제제 roscovitine 및 olomoucine 3 야생 형 Drosophila 애벌레 두뇌의 전직 생체내 치료는 actin 조직의 급성 변화를 일으키는, 그리고 여기에 표시유전자 Cdk5 활동이 결여 돌연변이에서 본 변화를 모방 세포 표면 단백질 Fasciclin 2의 국산화 인치

전 생체내 문화 기술의 두 번째 예제는 배아 버섯 본문 (MB) 애벌레에서 어른으로 변태하는 동안 감마 뉴런의 연결을 리모델링을 위해 제공됩니다. 버섯 몸은 후각 학습과 파리 4 메모리의 중심지이며, 이러한 감마 뉴런은 성인 innervation 패턴 5를 확립하기 위해 나중 timepoint에 다시 확장 지점 그리고 pupal 개발 중에 axonal와 돌기 가지를 치다합니다. MB 중 이러한 뉴런의 가지치기는 ecdysone 수용체 지하 1 층 7 시에 연기, ecdysone, 스테로이드 호르몬에 의해 실행되는 메커니즘에 의해, neurite 지점 6 지방 변성을 통해 발생하는 것으로 표시되고, 그의 활동에 따라 좌우되어 ubiquitin-proteasome 시스템 6. 전직 생체내의 culturing 우리의 방법은 B 수e는 더욱 발달 리모델링의 메커니즘을 심문하기 위해 사용. 우리는 전 생체내 문화 환경에서, MB 중 감마 뉴런은 생체내에서 해당과 비슷한 시간 코스 발달 가지치기의 과정을 recapitulated 것으로 나타났습니다. 그것은 세포 변형에 레스터 저지하기 위해 조직을 explanting 전에 1.5 시간 번데기 형성 이후까지 기다려야하지만, 필수입니다; 문화에 거의 없거나 전혀없는 변태로 이끌어 pupariation가 시작될 동물의 해부. 따라서, 적절한 수정으로 전직 생체내 문화 접근법뿐만 아니라 중앙 뇌 생물학의 안정 상태 측면과 같은 역동적인 공부를 적용할 수 있습니다.

프로토콜

미디어 A. 준비

  1. 필터 - 살균 슈나이더의 Drosophila 미디어 10 % 태아 소 혈청과 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신과 함께 보완하여 완벽한 미디어를 준비합니다.
  2. 미디어는 매번 신선한 준비되어야한다. 또는 미리 냉동 미디어의 신선한 나누어지는 각 사용하기 전에 해동 수 있습니다.
  3. culturing에 앞서, 10 μg / ML의 인슐린과 미디어 2 μg / ML ecdysone를 추가합니다. 약물은 농축 주식으로 준비하고 작은 aliquots에 얼려되었다. 해동 aliquots는 refrozen 아니었다.
  4. 모든 작업 솔루션은 25 ° C.로 유지되어야

애벌레의 두뇌 Culturing

1. 애벌레 두뇌의 선택 및 해부

  1. 12mm Millicell의 세포 배양 삽입에 미디어 500 μl를 추가합니다. 해부하는 두뇌는 쉽게 immunostaining을 촉진하기 위하여 다음과 삽입에 배치됩니다.
  2. 해부 시계 유리에 준비한 미디어의 소량을 추가합니다.
  3. U, 작은 주걱 노래를 방황하고 셋째 instar의 애벌레를 데​​리러와 시계 유리에 배치합니다. (우리는 전직 생체내 배양 방법은 첫 번째 또는 두 번째 instar의 유충에 동일하게 적용될 것이라고 생각되는데,하지만 우리는 이것을 테스트하지 않았습니다.)
  4. , 포셉 한 켤레와 애벌레의 뒷부분 끝을 개최하는 것은 신중 # 5 집게의 두 번째 쌍의으로 앞부분 엔드를 엽니다.
  5. 신속 복부 신경 코드가 그대로 유지 두뇌를 해부.

해부하는 애벌레의 두뇌 2. 전의 생체내의 culturing

  1. 사전 서부 유럽 표준시 피펫 팁을 사용하여 세포 배양 삽입, 미디어와 함께 미리 채워진로 조심스럽게 머리를 전송합니다.
  2. 25 인큐베이터로 미디어 전송 두뇌는, ° C가 올때까지 시간이 소수점 원하는 도달한다. 이 방법은 최대의 문화에 48 시간에 대해 효율적으로 작동합니다.
  3. 8시간에서 미디어를 교체합니다. 그 이상은 매체마다 5-6시간의 절반을 교체하십시오.

3. 의 Pharmacological 조작애벌레의 뇌는

전직 생체내의 culturing의이 방법은 pharmacologically 이전에 우리 실험실 1에서 보여준 유전자 상호 작용을 확증하는 데 사용할 수 있습니다.

  1. 100 μm의 제품 roscovitine 및 준비된 미디어 ~ 100 μm의 제품 olomoucine을 추가합니다.
  2. 이 미디어를 해부 머리를 전송합니다.
  3. 25 문화의 두뇌 ° 24 시간 동안 C #.
  4. 8시간에서 미디어를 교체합니다. 그 이상은 미디어의 절반 (마약)마다 5-6시간를 교체하십시오.

Pupal 두뇌 Culturing

1. 해부를위한 Pupae 선정

  1. 병 / 유리병에 흰색 pupae 표시한다.
  2. 오직 완전히 흰색입니다 pupae를 선택합니다. 그러다 어떤 종류가있는 Pupae는 포함해서는 안됩니다.
  3. 이 단계는 알에서 형성 (APF) 후 0시간입니다.
  4. 이러한 pupae은 1.5 시간 마킹 후 절개에 대한 준비가 될 것입니다. 이 단계는 그 발달 가지치기은 은퇴한 생체내에서 발생하는 유지를 위해 매우 중요 문화.

2. Pupae의 해부

  1. 12mm Millicell의 세포 배양 삽입에 미디어 500 μl를 추가합니다. (해부하는 두뇌가 쉽게 immunostaining을 촉진하기 위하여 다음과 삽입에 배치됩니다.)
  2. 원하는 시간 지점에 도달되면 절개 시계 유리에 준비한 미디어의 소량을 추가합니다.
  3. 소형, 젖은 주걱을 사용 pupae 이전에 해부용으로 표시 픽업 및 시계 유리에 배치합니다.
  4. 포셉 한 켤레로 pupae의 사후 끝을 개최하는 것은 신중 # 5 집게의 두 번째 쌍의와 번데기 케이스의 앞부분 끝을 엽니다.
  5. 신속 복부 신경 코드가 온전하고 첨부 유지, 두뇌를 해부.

해부 Pupal 두뇌 3. 전의 생체내의 Culturing

  1. 세포 배양 삽입, 미디어와 함께 미리 채워진로 조심스럽게 머리를 전송합니다.
  2. 원하는 시간-P까지 25 인큐베이터 ° C에서 미디어 전송 두뇌,oint에 도달한다. 우리는 표시된 실험을 위해 문화에 10 시간 동안이 방법을 사용하지만, 필요하다면 그것은, 관찰 및 치료의 긴 기간을 연장하실 수 있습니다.
  3. 8 시간 APF보다 시간 점 이상의 경우, 미디어마다 5-6시간를 교체하십시오.

이 단계에서 프로토콜은 애벌레와 pupae 모두 변하지 남아있다.

B의 해부 머리를 고정

  1. 원하는 시간 지점에 도달하면 미디어를 제거하고 1X PBS로 4 %의 포름 알데히드 500 μl를 추가 0.5 % Triton은 15 분이 신선한 포름 알데히드와 교체 30 분 X-100 (PBST),.에게
  2. 정착액과 미디어를 대체하면서 두뇌가 건조하도록하지 않도록하십시오.
  3. 0.5 % TritonX-100 (PBST)와 1X PBS 네 가지 십분 세차장과 포름 알데히드를 씻으십시오.

C.는 고정 머리 염색법

  1. 포름 알데히드를 씻어되고 나면, 1 % 정상에 1X PBS의 차단 용액에 1 시간 정도 머리를 차단염소 혈청과 1퍼센트 소 혈청 알부민.
  2. 솔루션을 차단에서 만든 일차 항체를 추가합니다.
  3. 4에 하룻밤 사이에 부화 뇌 ° C.
  4. 다음날 아침, PBST 네 가지 십분 세차장으로 일차 항체 씻어.
  5. 솔루션을 차단에서 만든 이차 항체를 추가합니다.
  6. 4 시간 동안 실온에 둡니다.
  7. PBST 네 가지 십분 세차장과 이차 항체를 씻으십시오.

디 현미경을위한 고정 및 스테인드 머리를 마운트

  1. 1 시간 Vectashield 장착 미디어 뇌를 평형.
  2. Vectashield 장착 미디어를 사용하여 유리 슬라이드에 두뇌를 탑재합니다.
  3. 커버 슬립을 장착하기 전에 두뇌의 양쪽에 유리 칩을 놓습니다. 공촛점 현미경으로 모든 초점 비행기를 스캔할 시료가 얇은 유지하면서 이것은 숙청되는 것을 두뇌를 방지합니다. 뇌는이자의 기능을 보는 촉진 장착시 약 지향했다. 필요한 경우뇌 이미지는 문서화 및 측정을위한 최적의보기를 제공하기 위해 Imaris 소프트웨어를 회전했다.
  4. 투명 매니큐어로 전표를 덮어 밀봉합니다.
  5. 스토어 멀리 빛과 슬라이드.

E. 대표자 결과

그림 1 (A) 야생 형 파리의 타사 instar 애벌레 두뇌의 패널을 보여줍니다 및 (B) Cdk5의 지배적인 음수 유도체 (Cdk5DN) (Connell - 크라 울리 외., 2000)을 표현하는 파리. 메가바이트 감마 뉴런의 두 특급 actin-GFP (녹색). 마찬가지로 앞에서 설명한 (Trunova 외., 2011), 따라서 "맑은 구역"(, 받침대)로 나타나 있으며, actin-GFP를 축적하지 못한 야생 형 감마 뉴런의 근위 axons에서 영역이 fasciclin 두 단백질 (빨간색)은 개까지만이 영역의 복부 국경 (흰색 수평선)에 axons에 쌓입니다. 그림 1 (A)의 세 번째 패널에서 점선은 연극을 강조, MB 중 위치를 나타냅니다"맑은 구역"과 복부 테두리 인치 Cdk5DN을 표현 파리에서 actin 맑은 구역에 결석 (B)와 Fasciclin 2 (FasII) immunoreactivity 그 지역을 통해 dorsally 펼쳐집니다. (가로 메가바이트 전체 FasII 양성 axons 프로젝트의 변수 숫자가주의, 이들은 표현형와 관련성이 없다.) 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다.

전직 생체내의 culturing 우리의 방법을 사용하여, 우리는 roscovitine 및 olomoucine, Cdk5 활동 pharmacological 억제제의 조합으로 야생 형 파리를 취급. 그림 2는 컨트롤의 공급 instar 애벌레 머리를 ()의 패널과 (B 약물 치료를 보여줍니다 ) 야생 형 파리. 24 시간 동안 Cdk5 억제제로 치료가 머리를 지배 부정 Cdk5 구조를 표현 파리와 마찬가지로, 특성 actin 맑은 구역의 손실과 FasII 경계의 변화 (대괄호)를 보여줍니다. 화이트 라인은 야생 형 FasII 경계의 위치를​​ 보여줍니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다.

Figu다시 3 mCD8-GFP (녹색) 멤브레인 타겟으로 표시 0-10시간 APF에서 Drosophila 버섯 기관의 대표 시리즈를 보여줍니다. 괄호는 꽃받침, 즉, MB 중 돌기 전망을 나타냅니다. 이전 변태로, 하나는 두껍고 번들뿐만 아니라 울창한 돌기 아버 (받침대)에서 발생하는 형광 신호의 '연무'에서 dorso-ventrally 전기 메가바이트의 axons을 볼 수 있습니다. 시간에 해부하는 패널 쇼의 두뇌는 지적했다. 지역 dendrites의 가지치기는 (axonal 신호가 영향을받지하지만) 6-8 시간으로 APF, 돌기 신호의 안개가 사라졌을 같은 것으로, 괄호로 표시합니다. 패널 B의 두뇌는 내부 ecdysone 스파이크 (트루먼과 Riddiford, 2002), 그리고 지적으로 교양 전직 생체내 전에 0시간 APF에서 해부했다. 이들은 dendrites 전혀 발달 가지치기를 보여 없으며 오히려 돌기 신호는 10 시간 APF에서 지속. 이것을 회피하려면, pupae 0 시간 APF에 표시되지만 1.5 시간 APF과 교양으로 해부한다. 창리터 C는 0-10시간의 APF에서 이러한 Drosophila 버섯 기관의 대표적인 시리즈를 보여줍니다. 비 교양 샘플 마찬가지로, 돌기 신호는 8 시간 APF에 의해 검출되지 않을 수도있어 그 효소됩니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다.

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토론

변이와 transgenes 표현을 포함한 조직 구조와 기능의 만성 유전자 조작은 일반적으로 구분하는 것은 매우 어려울 수 즉각적인 효과와 늦은 간접 결과의 조합을 생산하고 있습니다. 약리학과 유전 방식을 보완하는 것은 표현형 뒤에 시간 코스의 심문을 용이하게하실 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 Drosophila 10 spermatogenesis 동안 다른 cytoskeletal 구성 요소의 기여를 해부에 대한 강력한 접근 방식이었습니다. 현재의 예제에서, 우리는 Drosophila에서 AIS의 구조를 유지하는 Cdk5에 대한 영구적인 요구가있다는 것을 보여줄 수있다. 다른 실험에서 우리는 또한 약물을 사용하여 성공을 이뤄 냈습니다 그 단백질 kinases (imatinib), actin 중합 (cytochalasin, latrunculin 및 jasplakinolide)와 microtubules (vinblastine과 taxol)를 포함하여 대상 기타 세포 구...

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공개 사항

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

감사의 글

우리는 원고에 대한 그들의 조언, 유용한 토론 및 의견을 저희 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 또한 특히 우리가 개조 실험에서 culturing 위해 머리를 해부하기 전에 1.5 시간 APF 때까지 기다리는 것이 좋은 제안 마르타 코흐와 Bassem 하산을 감사드립니다. 우리는 또한 그들의 공촛점 현미경의 사용을위한 NHGRI 이미징 시설을 감사드립니다. 이 작품은 NINDS 교내 연구 프로그램, NIH (Z01 NS003106)의 기초 신경 과학 프로그램에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 최종 농도
슈나이더의 Drosophila 미디어 Invitrogen 21720-024
태아 소 혈청 (열-inactivated) Invitrogen 10082-1​​47 10%
페니실린 / 스트렙토 마이신 Invitrogen 15140-122 1퍼센트
인슐린 Invitrogen 12585-014 10μg/ml
Ecdysone 시그마 - 올드 리치 H5142 2μg/ml
Roscovitine 시그마 - 올드 리치 R7772 100μM
Olomoucine 시그마 - 올드 리치 O0886 100μM
정상 염소 혈청 Invitrogen 50062Z 1퍼센트
소의 알부민 세럼 피셔 과학 M9501 1퍼센트
포름 알데히드 시그마 - 올드 리치 D4551 4퍼센트
트리톤-X 100 피셔 과학 BP151 0.5 %
인산염은 염분 버퍼 Invitrogen 70011-044 1X
Vectashield 벡터 연구소 H1000
Millicell 셀 문화 삽입물 Millipore PI8P01250
Multidish 잘 사 써모 과학 176,740
뒤몽 # 5 포셉 파인 과학 도구 11251-20
현미경 슬라이드 피셔 과학 12-544-7
유리 커버 피셔 과학 12-548 - 5M

참고문헌

  1. Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
  2. Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
  3. Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
  4. Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
  6. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  7. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  8. Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
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  10. Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
  11. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
  12. Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
  13. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).

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