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방법 논문

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

14.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/4274

⸱

2012년 12월 20일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해 번식 체외에서 뉴런과 astrocytes로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서. 이 작품은 신경 progenitors은 선택의 성장 요인과 에어컨하여 oligodendrocytic 계보 (Lineage)의 단계를 통해 차별화하도록 유도 될 수 것으로 나타났습니다.

초록

neuronal와 glial 세포 유형으로 인간의 신경 progenitors의 차별화 신경 세포 계보 (Lineage) 개발의 분자 규정을 연구하고 비교하는 모델을 제공합니다. 태아 CNS 조직에서 신경 progenitors의 체외 확장에 잘 특징되었습니다. 체외 실험에서 충분한 인간의 oligodendrocytes을 획득 myelin 생산 oligodendrocytes에 태아 신경 progenitors의 직접 분화에 다양한 문화 조건 성인의 하위 대뇌 피질의 흰색 물질과 개발에서 glial progenitors의 식별 및 격리에도 불구하고 어려운 남아있다. galactocerebroside + (GalC)와 O4의 차별화가 + oligodendrocyte 전구체 또는 신경 전구체 세포의 전구 세포는 (OPC) 둘째 임신 태아 뇌를 사용하는 것으로보고되었습니다. 그러나, 이러한 전지는 astrocytes 뉴런 등의 지원 세포의 부재에서 세포 분열 따위에 의해 번식하지 않으며, 문화에 시간이 지남에 따라 빠르게 사라집니다. 필요가 체외 실험에서 적합 oligodendrocyte 혈통의 세포를 생산하는 문화 시스템 남아 있습니다.

기본 인간 oligodendrocytes의 문화 예를 들어, 생체에 그 세포를 감염 인간의 polyomavirus, JCV 같은 neurotropic 전염성 대리인의 pathogenesis을 연구 할 수있는 유용한 모델이 될 수 있습니다. 이러한 배양 세포는 중추 신경계 (CNS)의 다른 demyelinating 질병의 모델을 제공 할 수 있습니다. 뉴런 (전구 - 파생 뉴런, PDN)와 astrocytes (전구 파생 astrocytes, PDA)이 연구는 신경 progenitors을 유도 할 수 있다는 표시로 차별화 할 수있는 능력을 유지하면서 기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 신경 전구 세포는 체외에서 세포 분열 따위에 의해 번식 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 개발의 단계 (전구 파생 oligodendrocytes, PDO)의 많은을 통해 차별화합니다. DMEM-F12 혈청이없는 미디어의 우리 문화 신경 전구 세포는 저녁을 먹다기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF-AA), 소닉 고슴도치 (쉬), neurotrophic 요인 3 (NT-3), N-2 및 triiodothyronine (T3)로 plemented. 배양 세포는 대략 칠일 75cm 플라스크 당 2.5e6 세포에 passaged 있습니다. 이러한 조건에 사용 문화의 세포의 대부분이 몇 프로세스 및 A2B5 및 O-4 같은 사전 oligodendrocyte 세포의 명시 적 마커 특징으로 형태를 유지하고 있습니다. 우리가 네 가지 성장 요인 (GF) (bFGF, P​​DGF-AA, 쉬, NT-3)을 제거하고 PDN에서 설치된 미디어를 추가하면 세포는 GalC 및 myelin 등 oligodendrocyte 차별화의 특정 더 많은 프로세스와 명시 적 마커를 획득하기 시작 기본 단백질 (MBP). 우리는 oligodendrocyte의 독특한 마커를 식별 할 수 다색의 유동 세포 계측법을 사용하여 phenotypic 특성을 선보였습니다.

프로토콜

참고 : 신경 전구와 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 세포의 일상 배양를 들어, 부화는 37 번 ° C humidified 5 % CO 2 분위기에서 이루어집니다. 모든 2 일, 매체는 문화가 40~70%의 합류 경우 신선한 매체의 50~100%를 사용하여 대체됩니다. 근처 confluency의 시간에서, 문화는 보통 주간 일정에 2-2.5e6/T75 플라스크에 passaged 있습니다.

1. 코팅 휴대용 술병을 준비

  1. 코팅 플라스크 그런 다음 탈 이온수 (DI 물)와 코트 T75 플라스크를 100 ML에 폴리-D-리신 (PDL)의 5 밀리그램을 희석 준비 50 μg / 어둠 속에서 실온 (RT)에서 PDL의 ML. 1 ½ 시간 후, PDL을 기음과 DI-물에 한 번 플라스크를 씻어. 세포를 (표 1) 퍼 뜨리고 전에 건조 플라스크합시다.

2. 전구 - 파생 Oligodendrocytes (PDO)로 신경 전구 세포의 차별화를 시작

에 대한 프로토콜입니다인간 CNS의 전구 세포를 olate 것은 이전 발행물에서 설명하고이 프로토콜 1의 일부가 아닙니다. 인간 CNS의 전구 세포는 NIH 지침에 따라 취득 8 주 회임 태아 뇌의 telencephalon에서 고립되었다.

  1. 25 NG / ML bFGF의 20 NG / ML 표피 성장 인자 (EGF) (그림 1A)를 보충 neurobasal 중간에 PDL 코팅 플라스크에 신경 전구 세포의 multipotential 인구 성장. 통로 11 (p11)보다 높은 경우를 사용하지 마십시오.
  2. 문화가 약​​ 70 % 합류 할 때 신경 전구 세포를 차별화 할 시작합니다.
  3. 소 혈청 알부민, L-글루타민, gentamicin, N2 부품, T3, 쉬, NT-3, bFGF, 그리고 PDGF-AA (표 1) 보충 혈청이없는 DMEM / 햄 F12 1:1 매체를 사용하여 완벽한 차별화 oligodendrocyte 미디어를 확인 . 이 매체는 성장 요인 (oligo 중간 + GF)와 oligo 매체로 정의됩니다.
  4. progen를 제거플라스크에서 itor 미디어와 한 번 세포를 씻어 인산염 버퍼 생리 (PBS)가 다음 oligo 매체를 추가 + GF oligodendrocyte 차별화를 시작합니다 (2.3에서 설명 내용). oligodendrocytic 혈통 위해 최선을 다하고 만 셀 (그림 1B) 성장합니다. 3 주 동안은이 매체의 문화 셀을.
  5. 매주, 전지 90-95%의 합류, 통로들이 트립신 (0.05 %) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.1 %) (T75 플라스크 4 ML)을 사용하여에있을 때. 50 ML 원뿔 튜브에 passaged 할 셀에서 전체 미디어를 전송,이 완비 된 매체는 트립신을 해소하는 데 사용됩니다. 세포를 건조하지 있는지 확인하십시오. 그런 다음 트립신을 추가합니다.
  6. 부드럽게 셀 부대를 지원하기 위해 플라스크를 여러 번 도청, RT에서 5 분에 트립신의 세포를 배양.
  7. 분리 된 세포와 병에 설치된 매체의 4-5 ML을 추가하여 트립신을 해소.
  8. 같은 50 ML 원뿔 튜브로 매체와 세포를 전송합니다. 1200 RPM (~에서 매체와 세포를 원심 분리기300 XG) RT에서 5 분을위한.
  9. 표면에 뜨는을 대기음, 부드럽게 튜브를 팁, 세포 펠렛을 resuspend하고 신선한 oligo 매체 + GF를 추가합니다. 부드럽게 피펫 매체와 세포 위아래로는 단일 세포 현탁액을 확인합니다.
  10. 각각의 새로운 PDL 코팅 T75 플라스크에 세포, 및 전송 2.5e6를 계산합니다.

3. Oligodendrocytes의 차별화에 마지막 단계

  1. oligo 중간 + GF, 세포가 70~80%의 합류에 있습니다의 문화 3 주 후, 차별화의 마지막 과정 (그림 1C)를 시작합니다.
  2. oligo 매체 + GF과 같은 방식으로하지만, 네 개의 GF를 추가하지 않고 미디어를 준비 : 쉿, NT-3, bFGF와 PDGF-AA. GF - 네 개의 GF없이 해당 매체는 oligo 매체로 정의됩니다.
  3. 술병에서 oligo 매체 + GF를 대기음, PBS로 한 번 씻어하고 매체 16 ML의 총 볼륨을 추가 oligo 매체입니다 ¾ (12 ML)의 - GF와 ¼ (4 ML) PDN이 설치된 매체입니다에 대해 6-10 일). PDN에서 설치된 매체의 사용은 차별화 과정이나 세포의 생존에 중요한되지 않습니다. 우리는 실제로 공동 문화 실험에서 PDN 세포와 PDO 만 직접 접촉 PDO의 생존의 길이에 영향이 있다고 관찰했다. oligo 매체의 생존 시간 - PDO 세포가 PDN 세포와 공동 배양하는 경우 GF는 2 ~ 3 주에 연장 할 수있다. PDN에 인간의 신경 전구 세포를 차별화 할 수있는 프로토콜은 이전 발행물에서 설명하고이 프로토콜 1의 일부가 아닙니다. 여러 프로세스 (그림 1D)와 세포의 점진적 차별화 된 문화의 문화 중간 결과에서 성장 인자의 탈퇴.

4. 유동 세포 계측법 분석

유동 세포 계측법 분석은 부모 인구의 사람들과의 관계에서 차별화가 진행되는 동안 oligodendrocyte 마커의 인수를 비교합니다.

  1. 신경 프로를 사용컨트롤로 genitors. oligo 중간 + GF의 폴리-D-라이신과 코팅이 T75 플라스크에 2.5x10 6 셀의 씨앗 PDO 세포.
  2. GF - 다른 플라스크는 oligo 매체가 있었을 때 일주일 후, 세포 생존을위한 제어 문화 플라스크에 신선한 oligo 매체 + GF와 매체를 교체하십시오.
  3. 두 미디어에서 PDO 세포를 떼어 놓다하려면 20 U / papain의 ML과 트립신하지를 사용합니다. papain은 세포 형태를 보존 해리 동안 세포에 gentler 효과가 있기 때문입니다.
  4. papain의 유리 병에 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)의 5 ML을 추가합니다. 10 분 또는 papain이 완전히 용해 및 솔루션을 분명히 나타납니다 때까지 37 ° C에서 약을 놓으십시오. 이 세포를 떼어 놓다하는 데 사용되는 papain 솔루션입니다.
  5. Deoxyribonuclease I (DNase) 유리 병 (표 1)에 EBSS의 0.5 ML를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. 용해 papain의 약병이 솔루션의 0.25 ML을 추가합니다. 이 준비는 약 20 U / ML papain과 0의 최종 농도를 포함0.005 % DNase.
  6. 15-30 분을위한 37 ° C에서 세포와 배양에 장소 papain 솔루션 (위에서 설명), 현미경을 사용하여 세포의 부대를 모니터링 할 수 있습니다. 와 함께 또는 7 분에 1,200 RPM의 GF와 원심 분리기가없는 매체의 5 ML로 반응을 중지합니다.
  7. 두 개의 서로 다른 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 두 플라스크에서 세포 알약을 전송하고 정상 생리 매체 (NPM : 145 MM NaCl, 5 MM KCl, 1.8 MM CaCl 2, 10 밀리미터 Hepes 10 MM 포도당)로 씻어 1 MG / ML로 보충 소 혈청 알부민 (NPM + BSA).
  8. 표면이 4에 immunostaining 수행 ° GalC (표 2), A2B5, O4에 대한 구체적이고 적절하게 titrated 차 항체를 사용하여 20 분에 C.
  9. 5 분에 대해 4 ° C에서 NPM + BSA와 세포를 깨끗이 씻어 20 분 (표 2)에 대해 4 ° C에서 특정 보조 항체로를 품다.
  10. nestin, glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 클래스 III 및 수 등의 세포 항원을 착색하기타, - tubulin과 myelin 기본 단백질 (MBP) (표 2), RT 20 분 동안 2 % paraformaldehyde (PFA)에 셀을 수정하고 -20 ° C. 15 분 동안 차가운 70 % 에탄올로 permeabilize
  11. 1X PBS로 세포를 씻어하고 특정 보조 항체 (표 2)에 품다.
  12. 유동 세포 계측법 분석하는 동안 그대로 세포와 subcellular 부스러기 사이에 차별하기 위해 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochloride (DAPI) (생명 기술, 그랜드 아일랜드, NY)으로 세포를 얼룩.
  13. 위의 프로토콜을 최적화에서, 우리는 각 immunoreagent의 특이성을 확인하기 위해 모든 적절한 제어 실험을 수행했습니다. 간단히 직접 레이블 항체를 들어, 적절한 대조군은 기본 항체 (즉, isotype 제어)와 같은 면역 글로불린 isotype 클래스 (또는 서브 클래스)와 fluorochrome 켤레의 직접 복합 항체했다. 차 항체의 간접 immunostaining, 적절한 대조군 w에 대한특히 차 항체가 생성 된에서 호스트의 면역 글로불린 클래스 (또는 서브 클래스)를 목표로 관심 fluorochrome에 복합 보조 항체 있습니다. 여러 호스트 (마우스, 토끼, 닭)의 기본 항체를 함께 사용되었을 때, 우리는 일반적으로 최소화하기 위해 상호를 다른 호스트에서 면역 글로불린에 대한 교차 adsorbed 된 사용되는 각 호스트 및 각 보조 항체의 주요 항체을 대상으로 보조 항체를 사용 immunoreactivity를 개최했습니다. 긍정적 인 컨트롤이 항원에 대한 특정의 기본 항체를 직접 또는 간접적으로 immunoreactions을 사용하여 관심있는 항원을 표현하는 것으로 알려진 세포 준비를 직접 또는 간접적으로 immunostaining이 포함되어 있습니다. 위의 최적화 방법은 실험을 immunostaining의 각 유형에 대해 한 번 수행되었습니다. 제어 immunoreactions는 기본 및 보조 항체 중에서 더 큰 크로스 에피토프 immunoreactivity을 공개하지 않습니다. 유동 세포 계측법은 균일하게 수행되었다488 나노 미터, 647 나노 미터로 조정 여기 파장을 제공 세 레이저가 장착 FACVantage SE 셀 정렬 (BD Biosciences, 산호세, CA), 그리고 폭 넓은 UV (351-364 nm 정도) (그림 2)를 사용하여 정지 휘황 표시 셀 .

5. Immunofluorescence 분석

참고 : immunofluorescence 실험 PDO는 oligo 중간 + GF 또는 oligo 매체에 도금 있습니다 - PDL으로 코팅 6 잘 접시에 2.5e5에서 GF. 세포는 성장 요인의 탈퇴 후 여러 시간 지점에서 2퍼센트 PFA에서 수정되어 있습니다. 얼룩 항체는 플라스틱 6 잘 접시 대신 유리 coverslips에 수행됩니다.

  1. 미디어를 제거하고 2% PFA를 추가합니다. RT 10 분에 품다. PFA 폐기하십시오. PBS, 5 분마다 시간을 세포에게 3 번 씻으십시오. 세포를 건조하지 않도록주의하십시오.
  2. RT에서 10 분 동안 PBS에 0.​​25 % 트리톤의 솔루션을 사용 세포 마커에 대한 세포를 Permeabilize.
  3. 비 특정 바인딩, 블록 세포를 방지하기 위해 F또는 HHG (1 밀리미터 HEPES 버퍼, 2 % 말 혈청, 그리고 행크스 '균형 소금 솔루션 10 % 염소 혈청)와 10 분. HHG에 미리 정해진 농도에 따라 특정 기본 항체 (표 2) 희석. 세포에 희석 항체를 놓습니다. 셰이커에 또는 4 ° C 하룻밤에 RT에서 1 시간을 품다.
  4. 5 분마다 시간, PBS로 세포에게 3 번 씻으십시오. HHG에 미리 정해진 농도에 fluorochrome와 커플 링 적절한 보조 항체 (표 2) 희석. 세포에 희석 차 항체의 혼합물를 놓습니다. 어둠 속에서 흔드는에 RT에 품다 1 시간.
  5. 5 분마다 시간, PBS로 세포에게 3 번 씻으십시오.
  6. photobleaching 피하기 위해 셀에 DAPI와 골드을 연장하고 위에 유리 coverslip을 배치의 10 μl를 추가합니다. Axiovert 200M 형광 현미경 (Zeiss, Thornwood, NY) (그림 3)을 사용하여 라벨이 셀을 표시합니다.

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결과

이 70 % -80 % 합류 신경 전구 세포 배양 (그림 1A)에서 차별화 프로세스를 시작하는 것은 매우 중요합니다. 많은 세포는 특정 성장 요인을 포함 있기 때문에 전구에서 oligo 매체에 문화 매체를 변경 한 후에는 죽을 것이다. 이 oligodendrocytic 표현형에 커밋되지 신경 전구 세포의 성장이 새로운 매체 (그림 1b)에 의해 지원되지 않습니다 나타냅니다. 일주일 동안 oligo 중간 + GF의 부화는 좁은, 바이폴라 형태를 (그림 1B) 전시 중간 문화되었습니다. 세포는 oligo 중간 + 3~4주 (그림 1C)의 GF에 보관됩니다. 문화 매체의 성장 인자 탈퇴는 여러 프로세스 (그림 1D)와 세포의 점진적 차별화 된 문화되었습니다. 유동 세포 계측법는 데이터의 양적 표현에 사용됩니다.

그림 ...

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토론

이 프로토콜은 기본 인간 신경 전구 세포에서 태아 oligodendrocytes을 유도하고 유동 세포 계측법과 immunofluorescence 얼룩을 모두 사용하여 표현형을 특징하는 방법에 대해 설명합니다. 태아 CNS에서 신경 progenitors의 확장과 성장은 잘 1-4에 설명되어 있습니다. 이 성인의 흰색 물질 5-13에서 glial 전구체를 식별하고 분리 할 수 있습니다에도 불구 그러나, 체외 실험에서 충분한 인간의 oligodendrocytes을 획득하는 것은 어려운 남아있다. oligodendrocytes에게 14-21를 생산 myelin에 태아 신경 progenitors의 직접적인 차별화로 다양한 문화 환경의 발전의 여러 시도가 있었다. 이 프로토콜은 선택 성장 요소 (PDGF-AA, bFGF, 쉬, 그리고 NT-3), t로 보충 혈청 무료 매체에 3 주 동안 성장하면 O4 마커 (그림 2)를 표현 nest...

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공개 사항

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

감사의 글

이 연구는 국립 보건원, NINDS의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다. 저자는 편집을 돕기 위해 현미경과 파멜라 C.의 체질을 돕기 위해 분자 의학 및 신경 과학, 릭 Dreyfuss의 연구소의 모든 구성원을 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약의 이름 회사 카탈로그 번호 최종 농도
DME / 햄 F12 1시 1분 오메가 과학자 DM-251 1X
알부민 소 시그마 A9418 1퍼센트
Gentamicin 품질 체액 120-098-031 50 μg / ML
L-글루타민 품질 체액 118-084-061 이 MM
T3 시그마 T2877 3 NM
N2 구성 요소 Gibco BRL 17,502 1:100
NT-3 PeproTech 주식회사 450-03 이 NG / ML
쉬 R & D 시스템 1314-SH/CF 이 NG / ML
bFGF PeproTech 주식회사 100-18B 20 NG / ML
PDGF-AA PeproTech 주식회사 100-13A 10 NG / ML
PDL 시그마 P6407 50 μg / m
PFA 전자 현미경 과학 15,712 2퍼센트
트립신 품질 체액 118-087-721
Papain 워싱턴 LK003178 20 U / ML
DNase 튜브 워싱턴 LK003172 0.005 %
EBSS 워싱턴 LK003188
골드을 연장
과DAPI 		Invitrogen P36931

표 1. 시약.

기본 애비 (모든 1 μg / ML에서) 종 Isotype 출처 차 애비
유동 세포 계측법
A2B5-비오틴 마우스 IgM 선물 J. Nielson Streptavidin 페트로, Invitrogen, CA
O4FITC 마우스 IgM J. Nielson의 선물
A2B5 마우스 IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 마우스 IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC 마우스 IgG 3 Millipore, MA gαm IgG 3 PE, 남부 생명 공학, AL
MBP 닭 IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, 잭슨 Immu., PA
Nestin 마우스 IgG 1 Messam 외. 2000 28 gαm IgG 1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP 토끼 IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, 잭슨 Immu, PA
βIII의 tubulin 마우스 IgG 2 Covance, CA gαm IgG 2 - 페트로, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII의 tubulin
(1:1,500) 		마우스 IgG 2A Covance, CA gαm IgG 2A-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		토끼 IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, 잭슨 Immu, PA
(1:500)
MBP
(1시 50분) 		닭 IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, 잭슨 Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		마우스 IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1: 100)
GalC
(1시 10분) 		토끼 IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

. 유동 세포 계측법 및 immunocytochemistry의 assays에 사용되는 표 2 항체 (ABS) 항체 conjugates : PE, phycoerythrin, 페트로, phycoerythrin 텍사스 레드, AMCA, 아미노 메틸 coumarin - 아세테이트, 싸이, cyanine, FITC, fluorescein의 isothiocyanate IG :. 면역 글로불린. . AF : 알렉사 형석, gαm : 염소 안티 - 마우스, gαrb : 염소 안티 - 토끼, dαck : 당나귀 방지 닭.

참고문헌

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