방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
비 쥐 포유류의 주요 시각 피질에서 뉴런은 같은 방향 1-4, 방향 5-7, 안구 지배력 8,9와 쌍안경 격차 구 등의 자극 기능에 대한 자신의 선호에 따라 클러스터됩니다. 오리엔테이션 선택성이 가장 널리 연구 기능 및 원하는 방향의 준주기적인 레이아웃과 지속적인지도 전체 기본 시각 피질 10,11에 걸쳐 존재합니다. 이 기능지도에 자극 선택적 응답을 초래할, 신경 세포 및 네트워크 기여를 통합하면 mm 공간적 스케일로 하위 미크론에 걸쳐 이미징 기술의 하이브리드가 필요합니다. 기존의 고유 신호를 광 이미징을 통해 시각 피질의 전체 표면에 걸쳐 기능지도의 전체적인 레이아웃은 12 결정될 수있다. 칼슘 민감한 염료를 사용하여 생체 내 두 광자 현미경의 개발은 synapt을 결정하는 하나를 수IC의 입력은 개별 neuronal 세포 기관 6,14 수백에서 동시에 각각의 수지상의 쪽에서 13 또는 기록 활동을 도착. 따라서, 두 광자 현미경의 하위 마이크론 공간 해상도로 고유 신호 영상을 결합하는 것은 수지상 세그먼트 및 세포 네크로의 모든 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 정확히 결정의 가능성을 제공합니다. 여기 빠르게 대뇌 피질의 방향지도를 취득하고 비 쥐 포유류에 형광 염료와 뉴런을 라벨이 기능지도의 특정 마이크로 도메인을 타겟팅 할 수있는 높은 수율 방법을 보여줍니다. 두 광자 이미징에 사용 된 것과 같은 현미경으로, 우리는 먼저 고유 신호 광학 이미징을 사용하여 오리엔테이션지도를 생성합니다. 그럼 우리가 어느 라벨을 염료로로드 micropipette를 사용하여 관심있는 마이크로 도메인을 타겟팅하는 방법을 보여 neuronal 세포 기관 또는 라벨 수석, 쪽과 axons은에서 볼 수있는 그러한 하나의 뉴런을의 인구생체. 앞의 방법을 넘어 개선이 neocortical 기능 아키텍처의 프레임 워크의 하위 세포 해상도 neuronal 구조 - 기능 관계의 시험을 용이하게합니다.
프로토콜
1. 외과 준비
- 마취를 유도하고 지속적으로 심장 박동을 모니터링 갯벌 CO 2, EEG, 온도를 모두 종료합니다. 모든 절차는 사우스 캐롤라이나의 의과 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 우리는 이전에 9,15을 발표 이들에 기초했다.
- 메스 블레이드로 피부를 절단하여 두개골의 등 표면을 쉽게받을 수 있습니다. Brudon의 퀴렛를 사용하여 뼈를 놓인 결합 조직을 해부. 면 스쳐 applicators과면 거즈를 사용하여 뼈를 청소합니다. 작은 사자의 정맥을 통해 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 두개골에 뼈 왁스 (필요에 따라) 적용됩니다.
- 검은 색 페인트 (자료 참조)과 혼합 치과 시멘트를 사용하여 두개골 (craniotomy을 수행 할 것입니다 관심 지역 이상)에 티타늄 스테인레스 스틸 헤드 판을 연결합니다. 머리 판의 중앙에 사각형 오픈 craniotomy에 대한 액세스 및 광학 이미징을 제공합니다. 머리 판 위에 금속 챔버를 연결합니다. 이 챔버는 물 침적 목적 렌즈와 이미징을위한 유체 저수지 역할을합니다.
- 금속 게시물을 사용하여 XY 스테이지에 헤드 판을 고정합니다.
- 치과 드릴을 사용하여 headplate의 사각형 오픈에서 뼈의 넓은 지역을 희석. 얇게 할 영역은 잘 계획 craniotomy의 경계를 넘어 확장해야합니다. craniotomy 사이트에서, 뼈의 두께가 coverglass과 neocortical 표면 사이의 아가로 오스의 두께를 지시하기 때문에 고해상도 이미지가 네크로에서 획득 할 경우 비 쥐 포유류의 두꺼운 두개골은 (아래 참조) 얇게해야합니다 .
- craniotomy의 뼈에서 2 X 2mm 광장 윤곽을 뚫는다. 뼈 조각을 제거하고 기본 피질에 열 손실을 최소화하기 위해 새로운 인공 뇌척수 (ACSF)에 정기적으로 실을 씻어. 필요에 따라 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다.
- 난생t # 3 포셉과 뼈 플랩.
- 제외한 모든 좋은 포셉 (# 5CO)와 Vannas 스프링 가위를 사용하여 경질의 맨 아래 레이어를 제거합니다. 비 쥐 포유류의 경질은 두껍고 불투명하지만 서로 다른 층으로 제거 할 수 있습니다. 출혈은 드문이지만, Gelfoam으로 중단 할 수 있고 어떤 혈흔이 부드럽게 경질는 포셉을 사용하고 ACSF와 린스의 나머지 계층에서 제거해야합니다. 경질의 마지막 층은 투명하고 pial 선박은 확실하게 표시됩니다. 고유 신호 이미징 동안 경질의 최종 레이어를 그대로두면 (토론 참조) 실험 이후 두 광자 이미징 단계에 형광 칼슘 지표 대량로드의 성공 속도를 증가 할 것이다.
- 따뜻한 2% 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 드롭을 적용하고 즉시 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 호흡기 및 심장 혈관 pulsations은 수술 해부 현미경이나의 oculars 사용하여 최소한 있는지 확인하기 위해 craniotomy을 확인 두 -밝은 분야 모드에서 광자 현미경.
2. 고유 신호 광학 이미징
- 고유 신호 이미징 동안 건조에서 아가로 오스를 방지하기 위해 coverglass의 바깥 주위에 ACSF로 적셔 젤 거품을 추가합니다.
- 두 광자 현미경 (그림 1) 위의 표준 C-마운트 포트에 고유 신호 이미징 CCD 카메라를 연결합니다. XY 스테이지 (그림 1A) 근처의 공기 테이블에 조명 광원을 배치합니다. 위치 및 craniotomy 및 headplate / 챔버 (그림 1B)를 통해 빛 가이드를 확보. 고유 신호에 필요한 반사 붉은 빛이 CCD 카메라 (그림 1C-D)에 craniotomy에서 직접 통과 할 수 있도록 기본 이색 성 및 C-마운트 포트 아래에있는 거울을 취소. 4 배 공기 목적 (0.13 NA, 17mm WD),보기의 2 X 2mm 필드를 사용하면 고유 신호 이미징 사용할 수 있습니다.
- 리터에 열 필터를 삽입난방에서 피질을 방지하기 위해 항공 경로를 설정합니다. 녹색 빛 (546 nm의 중심 λ)와 대뇌 피질의 표면 혈관의 디지털 참조 이미지를 기록을 통과 필터를 사용합니다.
- 대뇌 피질의 표면 아래 500 μm로 Z 포커스를 이동합니다. 고유 신호를 측정하는 피질을 밝히는 빨간색 필터 (630 nm의 중심 λ)를 사용합니다. 대뇌 피질의 표면이 균일하게 조명되는 등의 빛 가이드를 배치합니다. 시각적 자극 디스플레이에 의해 발생 된 빛에서 craniotomy을 보호. 시각적 자극과 기록 반사율 데이터 이미지의 순서를 제시한다. 10 분 내에 오리엔테이션지도를 생성하려면, 8 자극 (각 방향 4 방향 및 두 방향)의 순서 4 반복에 해당하는 데이터를 수집합니다.
- 거짓 컬러 방향지도를 생성하는 고유 신호 데이터를 분석합니다. 뉴런의 두 광자 라벨, 예를 들어, 오리엔테이션 바람개비의 이론에 대한 잠재적 타겟 지역 선택 -지도에서 지점 위치모든 기본 방향은 (그림 2A) 수렴. 오리엔테이션지도와 대뇌 피질의 표면 vasculature (그림 2B-C)의 이미지를 입혀 라. 대형 혈관과 arterioles 15 위치를 피하고 대상을 선택 기능 도메인 및 대형 표면 선박의 위치의 레이아웃을 사용합니다.
3. 형광등 칼슘 지표의 대량로드
- 5 μl DMSO에 1g의 Pluronic을 추가하여 20 % Pluronic / DMSO의 솔루션을 준비합니다. 완전히 Pluronic를 해산하기 위해 10 분 동안 60 ° C에서 혼합물을 가열. 혼합물이 실내 온도에 냉각 할 수 있습니다. 형광 칼슘 표시기 오레곤 그린 488 Bapta-1시 (AM OGB-1)의 50 μg의 유리 병에 Pluronic / DMSO 혼합물의 4 μl를 추가합니다. 그런 다음 빨간색 염료 (알렉사 형석 594, 2 MM 주식 솔루션) 1 μl와 OGB - 새벽 1 시까 지 1 ㎜의 최종 농도에 대한 피펫 솔루션의 35 μl를 (자료 참조) 추가 할 수 있습니다. 에 ½ 시간에 대한 솔루션을 Sonicate차가운 물 목욕 후 불순물을 제거 할 필터 0.45 μm와 원심 분리기.
- 2.0-2.5 μm의 외부 팁 직경 긴 테이퍼 피펫을 당겨. 피펫으로 염료 혼합물의 5 μl를로드합니다.
- 피펫 삽입을 용이하게하고 최고 품질의 두 광자 이미지를 얻을 경질의 마지막 층을 제거합니다.
- 피펫은 대뇌 피질의 레이어 3분의 2 년에 목표에 도달하기 위해 배치해야하는 대뇌 피질의 표면에 정확한 위치를 결정합니다. 우리 미리 대뇌 피질의 목표는 방향지도 (그림 2)에 바람개비 특이점입니다. 피펫은 챔버 벽과 목적 사이를 통과하기 위해 30 ° 각도로 피질로 구동해야합니다. 따라서, 200 μm 대뇌 피질의 표면 아래에 대상 지역을 라벨, 대뇌 피질의 표면에 피펫 항목 위치가 대상 위치 (그림 3 AB)에 측면 약 350 μm 될 것입니다.
- (XY 스테이지를 이동하는 동물과 Pipette의 micromanipulator은 센터 목적 (그림 3C)에서 대뇌 피질의 표면 입력 위치에) 배치됩니다. 피펫 쉽게 craniotomy의 벽을 따라 목적이나 뼈를 건드리지 않고도 피질을 입력 될 수 있도록 최소 3 ㎜ (자료 참조) 작동 거리 (WD)으로 20x 또는 40x 목표를 사용합니다. 항목의 위치는 목표 아래 중앙되면, 2mm (그림 3D)에 의해 목표의 Z 위치를 올립니다. 녹색 에피 형광 빛이 피펫에 빨간색 알렉사 염료를 시각화에 대한 설정으로, (그 팁을 중심으로 될 때까지 직접 대뇌 피질의 표면 항목 위치 위의 목적에 따라 (그리고 집중) 피펫을 이동 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 그림 3E).
- 지속적으로 ocu을 통해 피펫 팁을 보면서 피펫은 대뇌 피질의 표면 (그림 3 층)에 도달 할 때까지 피펫 수직을 (Z 축을 따라) 낮 춥니 다현미경의 라스 요. 밝은 분야 조명을 사용하여 대뇌 피질의 표면 혈관과 남아있는 수막 멤브레인 (피아와 거미집 모양의)는 피펫은 대뇌 피질의 표면을 접근으로 쉽게 볼 수 있습니다. 피펫가 원하는 항목 위치에 도달하지 않는 경우, 피펫을 마련하고 대뇌 피질의 표면에 혈관 랜드 마크를 기반으로 타겟팅을 재조정.
- 목표를 제거 craniotomy에서 초과 중추 신경계를 등심과 보푸라기가없는 흡수 창을 사용하여 인접한 뼈를 건조. craniotomy (그림 3G)를 통해 볼 수 있습니다 피질을 안정하는 따뜻한 3퍼센트 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 방울을 적용합니다. 비 설치류에서 3% 아가로 오스는 뉴런의 형광 염료의 성공적인 이해에 pulsations을 저해 할 필요가 있습니다. 2퍼센트 아가로 오스와 coverglass의 조합에 필요한 안정성을 제공하기 때문에 고유 신호를 광 이미징의 경우 불과 2 %의 아가로 오스가 필요합니다. 여기 더 coverglass는 3% 아가로 오스 그래서 염료로드 단계를위한 것입니다 사용되지 않습니다필요. 아가로 오스가 확정 된 후 ACSF과 챔버를 40x 목표를 삽입 (0.8 NA, 3.3 mm WD)하고 다시 작성하십시오.
- 밝은 분야의 두 광자보기로 전환하여 피펫 팁을 찾습니다. 그 끝이 피질 (그림 3H)에서 원하는 깊이를 도달 할 때까지 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 피펫 이동합니다. 염료 혼합물 (몇 PSI, 각 펄스 0.1 초)의 수시 압력 분출 퍼프는 막힘에서 피펫 팁을 방지하는 데 도움이됩니다. OGB-1은 세포를 입력시 표시됩니다 AM 때문에, 붉은 알렉사 염료는 피질 내부의 피펫 팁의 시각화를 위해 중요합니다.
- 피펫 팁의 깊이를 확인하는 대뇌 피질의 표면에 재 집중, 염료의 전체 용량과 목표를 대뇌 피질의 층 3분의 2의 뉴런을로드하고 끝이의 레이아웃에 따라 대상 위치에 있는지 확인하기 전에 표면 혈관. 피펫은 레이어 3분의 2 인 경우, 염료 혼합물의 작은 퍼프가를 조명한다세포 공간과 어두운 그림자처럼 원형 세포 기관의 조밀 한 조립을 알 수있다.
- 대뇌 피질 300-600 μm 직경의 영역에 neuronal 세포의 시체를로드를 들어, 30-90 펄스, 각 펄스 1.0 초, 2-10 PSI를 사용하여 세포 공간으로 염료 혼합물을 주입. 압력 펄스는 조직 움직이 너무 강한 안됩니다. 주입이 완료되면, 몇 분 기다린 다음 피펫과 목표를 제거합니다. OGB-1 뉴런에 의해 완벽하게 촬영 업 할 수 있도록 오전 1 시간 기다립니다.
- 염료로드에 사용 된 아가로 오스를 제거하고 녹음 챔버를 씻어. 표면에 2~3% 아가로 오스의 작은 방울을 넣고 빠르게 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 형광 염료가 빛에 민감한 때문에, 밝은 필드 또는 에피 형광등에 피질이 과잉 노출하지 마십시오. XY 단계를 사용하여 목적에 따라 목적 홀더 및 재 중심이라는 대뇌 피질의 영역으로 높은 NA (1.0) 20x 목표를 넣습니다. 예에서 craniotomy을 보호traneous 광원, 예를 들어, 시각 자극 디스플레이, 정전 소재의 여러 레이어를 사용합니다.
4. 형광 염료의 단일 셀 Electroporation
- 수지상 형태를 연구의 경우, 100 μM 알렉사 형석 594 (2 MM 알렉사 형석 594 주식 ACSF에 1시 20분 희석)의 솔루션을 준비합니다. 수석의 기능 이미징을위한 OGB 소금은 16,17을 사용할 수 있습니다.
- 1 μm의 끝 크기가 긴 테이퍼 피펫을 뽑아 피펫으로 염료의 5 μl를로드합니다. 기능 도메인을 타겟팅하는 다른 모든 단계를 대량로드 방법 (그림 1-3)과 동일합니다. neuronal 전지 본체 막에 인접한 피펫 팁을 위치, 전극 임피던스의 증가를 모니터링하고 세포 공간을 조명하고 두 광자 이미징 동안 그림자처럼 세포의 시체를 볼 수있는 염료의 압력 퍼프를 적용 할 수 있습니다.
- 피펫 팁은 neuronal 전지 본체 막에 인접한 경우, 적용 할 Axoporator 800A를 사용1-3 펄스 (-8에 -10 V, 10 밀리 초 펄스). 염색과 신경의 즉각적인 충전이 두 광자 현미경으로 쉽게 시각화입니다. 피펫를 제거하고 생체의 수석과 axons의 고해상도 이미지를 수집합니다.
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결과
우리 염료 라벨 방법의 정밀도를 설명하기 위해, 우리는 비 쥐 네크로에 알려진 기능지도의 가장 작은 마이크로 도메인을 대상으로. 띄엄 띄엄 이론은 기본 영상 피질의 방향지도를 통해 끝까지. 이들은 모두 원하는 방향 이러한 수렴 지점에서 발생하는 선호하는 취향, "풍차"(그림 2A-B)와 같은 특이한 모양 주변 지역의 위색지도 인치 craniotomy 당 하나의 바람개비는 특히 15 대형 선박과 arterioles을 방지해야하는 것 염료 라벨 (그림 2C에 녹색 동그라미)으로 선택됩니다. OGB-1스러워 대량로드로 방향 격자 시각적 자극의 순서로 neuronal 칼슘 표시기 형광의 추적 변화는 바람개비 이론과 주변의 단일 셀 해상도 기능지도를 (그림 4) 공개한다. 단일 셀 electroporation로, 수석과 axons의 공간 조직에서바람개비의 특이점에있는 화롯불 신경 세포는 생체 ...
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토론
우리는 네크로의 미리 정해진 기능 마이크로 도메인에 neuronal 세포 기관 (또는 수석과 axons)의 라벨을 타겟팅하는 방법을 제시한다. 두 광자 현미경과 고유 신호 광학 이미징을 병합하는 시냅스와 세포가 어떤 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 결정의 가능성을 제공 여부 기능지도에서 뉴런의 위치, 그리고 neuronal 회로와 neuronal 선택성의 상호 구성 요소를 시각적 경험 7 임상 치료 약물 (18)의 응용 프로그램과 그 변화.
자극 방향, 방향, 안구 지배력, 또는 쌍안경 차이에 대한지도는 성인 야생 형 설치류 6,19-21의 시각적 피질에보고되지 않았습니다. 그러나, 형광 염료와 뉴런를로드하고 마우스에 사용할 수있는 강력한 유전자 도구와 함께 이미지 안정성을 달성의 용이성이 연구의 대부분이 발생하고 있습니다설치류 대신 ferrets, 고양이, 그리고 원숭이에서 수행되는 대뇌 피질의 2 광자 이미징...
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
그림 5A에 표시된 수석을 추적하는 그레이스 디온;이 작품은 또한, 우리는 수술 절차에 도움을 마 Petrella 감사 국립 안과 연구소 R01EY017925과 R21EY020985과 데이 & 화이트 홀 재단에서 PK까지 자금의 보조금에 의해 지원되었으며, Pratik Chhatbar에 대한 원고에 대한 의견.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 시약 / 재료의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 코멘트 | |||||
| 1. 생활 지원 / 실험 사립 | ||||||||
| Isoflurane | 웹스터 뇌려 | NDC 57319-474-05 | ||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | ||||||
| 의견 조절 난방 담요 | 하버드 장치 | 50 7079F | ||||||
| ECG 모니터 | Digicare 생명 | LifeWindow 라이트 | ||||||
| EEG 증폭기 | AM 시스템 | 1800 | ||||||
| EEG 디스플레이 모니터 | 휴렛 패커드 | 78304A | ||||||
| 갯벌 CO 2 모니터를 종료 | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | 환기를 최적화 | |||||
| 드릴링 뼈에 초경 드릴 burrs | 헨리 Schein | 고급 (0.5 mm 팁) 및 정밀 (1.25 mm 팁) | ||||||
| headplate / 챔버 용 시멘트 | Dentsply | 675571, 675572 | ||||||
| 블랙 파우더 온도 그림판 | 사전 트 아트 주식회사 | 22-7185 | 빛 차폐을 개선하기 위해 시멘트 반사를 줄이기 위해 추가 | |||||
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| 내장 하드웨어 / 소프트웨어 | 광학 이미징 주식회사 | 영상 3001 / VDAQ | VDAQ 소프트웨어는 삽화 이미지에 사용됩니다 | |||||
| CCD 카메라 | Adimec | Adimec-1000 | ||||||
| 광원 전원 공급 장치 | 한전 | 15 15M를 ATE | ||||||
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| 20x (0.5 NA, 3.5 mm WD) | 하늘 | UMPLFLN20X | 0.5 NA 목표는 (아니라 2 광자 이미징 용) craniotomy을 통해 피펫을 정렬으로 만 사용됩니다 | |||||
| 20x (1.0 NA, 2.0 mm WD) | 하늘 | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40x (0.8 NA, 3.3 mm WD) | 하늘 | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| 에어 테이블 | 뉴 포트 (Newport) | ST-200 | 외부 진동의 준비를 분리 | |||||
| XY 스테이지 | 마이크의 기계 (주) (Attleboro, MA) | XY 스테이지에 배치 실험 주제와 셔터의 micromanipulator | ||||||
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참고문헌
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