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방법 논문

면역 요법에 대한 종양 항원로드 성숙 수지상 세포의 준비

17.9K 조회수

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DOI:

10.3791/50085

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2013년 8월 1일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Institute, NYU Langone Medical Center, 2Infectious Diseases, NYU Langone Medical Center

이 논문에서

요약

종양 면역 요법에 사용하기 위해자가 수지상 세포의 큰 숫자 (DCS)를 생성하기위한 가장 일반적으로 사용되는 방법을 설명합니다. 방법은 단핵 세포에서 수지상 세포를 분화하는 IL-4, GM-CSF를 사용합니다. 그들은 환자에게 다시 주입하기 전에 미성숙 수지상 세포는 성숙하고 항원과 함께로드를 자극한다.

초록

임상 연구는 항원 -로드 DC 백신은 안전하고 종양 1 유망한 치료 것을 설치하는 동안, 그들의 임상 효능은 확립되어야 남아있다. 이 방법은, 좋은 제조 공정 (GMP) 지침에 따라 준비, 아래에 설명 된 임상 연구 2 수지상 세포의 큰 숫자를 생성하기위한 가장 일반적인 전직 생체 제조 방법의 최적화입니다.

우리의 방법은 합성 TLR 3 작용제 수지상 세포를 자극하는 Polyinosinic-Polycytidylic 산성 폴리-L-라이신 카복시 메틸 셀룰로오스를 (폴리 ICLC)를 사용합니다. 우리의 이전 연구는 CD83과 CD86, 인터루킨-12의 유도 (IL-12), 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론 감마 유도의 상향 조절에 의해 평가로 폴리 ICLC 인간 DC에 대한 가장 강력한 개인의 성숙 자극이다 설립 단백질 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) 및 유형 I 인터페론 (IFN), 그리고 최소한의 인터루킨 10 (IL-10) 생산. 수지상 세포는 채집 술에 의해 얻어진 림프구가 냉동 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액)에서 차별화된다. 말초 혈액을 Ficoll 기울기 원심 분리하여 분리 및 분취에 고정되어 있습니다. 1 일에서 말초 혈액을 해동하고 ° C에서 조직 문화 인큐베이터 37 1-2 시간 배양 한 후 플라스틱 표면에 부착 단핵구를 위해 선택하는 조직 문화 플라스크에 도금. 배양 후 림프구는 씻어하고 부착 단핵 세포는 인터루킨-4의 존재 (IL-4)와 미성숙 수지상 세포로 분화하는 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 5 일 동안 배양한다. 6 일에, 미성숙 수지상 세포는 백신의 품질에 대한 관리 역할 및 백신 3의 면역 원성을 높일 수있는 열쇠 구멍 삿갓 조개 헤 모시 아닌 (KLH) 단백질과 펄스 있습니다. 수지상 세포는 성숙 자극 펩티드 항원로드 하룻밤 배양한다. 7 일에 세포를 세척하고 포함 1 ML의 분주에 냉동4 - 제어 속도 냉동고를 사용하여 20 X 10 6 세포. 수지상 세포의 배치를위한 방출 시험이 수행되고 그들이 환자에 주입되기 전에 최소 사양을 충족해야합니다.

프로토콜

1. 말초 혈액 4의 분리 및 냉동

  1. 무균 스파이크 플라즈마 전송 집합을 사용하여 leukapheresis 부대에있는 액세스 포트 중 하나입니다. 60 ML의 주사기를 사용하여 멸균 500 ML 병에 환자로부터 얻은 leukapheresis를 전송합니다.
  2. 상온 RPMI를 사용하여 원래 볼륨을 2 배 leukapheresis의 볼륨을 조정합니다. 철저하게 섞는다.
  3. 부드럽게 Ficoll-Paque PLUS의 병을 섞는다. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 12 ML Ficoll-Paque PLUS를 추가합니다.
  4. Ficoll을 포함하는 각 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 희석 leukapheresis 제품의 부드럽게 층 30 ML. Ficoll과 세포 현탁액 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록주의하십시오.
  5. leukapheresis의 모든 계층 될 때까지 단계 1.3 및 1.4를 반복합니다.
  6. 없이 브레이크와 실온에서 20 분간 1,000 × g에서 50 ML 원뿔 튜브를 원심 분리기.
  7. 조심스럽게 각 튜브 및 transfe에서 말초 혈액의 흐림 층을 수확새로운 멸균 50 ML 튜브에 대한 연구.
  8. 50 ML의 최종 볼륨에 각 튜브에 RPMI를 추가합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
  9. 4 10 분 ° C 풀 브레이크를 위해 500 × g에서 세포를 원심 분리기.
  10. 각 튜브에서 상층 액을 제거합니다. 각 튜브에서 세포 펠렛을 Resuspend하고 50 ML의 최종 볼륨에 RPMI를 추가합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
  11. 4시 6 분 ° C.에 대한 500 × g에서 세포를 원심 분리
  12. 각 튜브에서 상층 액을 제거합니다. 를 Resuspend 한 50 ML 원뿔 튜브에 함께 풀 세포 현탁액.
  13. 위로 더 RPMI 50 ML에 풀 말초 혈액의 양을 가져옵니다. 반전에 의해 부드럽게 섞는다.
  14. 4시 6 분 ° C.에 대한 300 × g에서 세포를 원심 분리
  15. 상층 액을 제거합니다. 50 ML RPMI에있는 세포 펠렛을 resuspend. 균일 한 세포 현탁액을 보장하기 위해 부드럽게 섞는다.
  16. 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
  17. 300에서 세포를 원심 분리4시 6 분 × g ° C. 냉동 매체를 준비합니다. 인간 AB 혈청 (밸리 생명)에서, 냉동 매체는 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO있는 Miltenyi Biotec은)으로 구성되어 있습니다.
  18. 상층 액을 제거합니다. 2 × 10 8 세포 / 차가운 냉동 미디어 ML의 최종 농도에서 세포를 resuspend을.
  19. 1.8 ML의 cryovials 1 ML의 aliquots을 확인합니다.
  20. 제어 속도 냉동실에 cryovials를 전송하고 동결 실행, 프로그램 시작 1. 실행의 끝에, 즉시 액체 질소 냉동고의 기상에 냉동 cryovials를 전송합니다.

2. 일 0 단핵구에서 수지상 세포의 분화

  1. 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 30 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다.
  2. 37 ° C의 물을 욕조에서 교반하여 냉동 말초 혈액의 해동 분주. 완전히 해동 할 때, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 튜브의 내용을 전송합니다. 철저하게 섞는다.
  3. 6 분 동안 세포를 원심 분리상온에서 500 × g에서. 상층 액을 제거하고 RPMI / 1 %자가 혈장의 작은 볼륨 펠렛 세포를 resuspend을. 다음 50 ML의 최종 볼륨에 더 RPMI / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 철저하게 섞는다.
  4. 500 6 분 × g, 실온에서 다시 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 50 ML RPMI / 1 %자가 혈장 펠렛을 resuspend을. 철저하게 섞는다.
  5. 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
  6. 판 1.40 40 RPMI의 ML / 225cm 2 EasyFlask 위에 1 %자가 혈장에서 x 10 8 세포. 모든 세포가 도금 될 때까지 반복합니다.
  7. 1 옆으로 납작 EasyFlasks 품다 - 37 2 시간을 ° C 조직 문화 인큐베이터는 단핵구가 술병을 준수 할 수 있도록 5 % CO 2를 포함합니다.
  8. 배양이 완료되면, 인큐베이터에서 EasyFlask을 제거하고 비 부착 세포에게 USI 제거를 두 번 세척prewarmed RPMI의 NG 30 ML.
  9. 두 번째 세척 후, 400-1,000 IU / ML IL-4, 100-1,000 IU / ㎖ GM-CSF 5-8 40 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 이 프로토콜에 대한, 우리는 400 IU / ML IL-4, 100 IU / ㎖ GM-CSF를 사용하고 있습니다.
  10. 37 2 일간 EasyFlasks을 품어 ° 조직 문화 인큐베이터에서 C가 5 % CO 2를 포함.

3. 주 2 : IL-4, GM-CSF와 수지상 세포의 먹이

  1. 각 EasyFlask에 400-1,000 IU / ML IL-4, 100-1,000 IU / ㎖ GM-CSF와 4 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장을 추가합니다. 소용돌이 옆으로 흔들어 섞는다.
  2. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 5 % CO 2를 포함에서 더보기 3 일 EasyFlasks을 (5 일까지) 품어.

4. 5 일 : 미성숙 수지상 세포의 수확

  1. 적극적 플라스크 소용돌이에 의해 비 부착 느슨하게 자기편 세포를 resuspend을하고 위아래로 pipetting하여 문화를 수확. 를 전송새로운 50 ML 원뿔 튜브에 수확 세포.
  2. 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ML RPMI / 1 %자가 혈장에있는 세포 펠렛을 resuspend. 철저하게 섞는다.
  3. 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
  4. 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 플레이트 1-2 × 10 400 IU / ML IL-4 및 6 - 잘 조직 배양 플레이트에 100 IU / ㎖ GM-CSF 3 ML RPMI / 1 %자가 혈장에서 잘 당 6 셀.
  5. 37 접시를 품어 ° C는 조직 문화 인큐베이터 2 밤새 5 % CO를 포함.

5. 6 일 : 수지상 세포의 성숙과 항원 로딩 중

  1. 10 ㎍ / ㎖ KLH에 6 자 문화 접시에있는 우물의 1 / 3 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 판 섞어. KLH는 첫 번째 DC 백신에 사용되기 때문에 KLH는 우물의 1 / 3에 추가됩니다. 이후 DC 백신 콘만 종양 항원 펩티드를 테인.
  2. 수지상 세포는 다양한 자극을 사용하여 성숙 자극 할 수 있습니다. 임상 연구에 사용 된 가장 일반적인 성숙 자극 크린 시토 킨의 칵테일 (TNFα, IL-1 β, 및 IL-6)과 프로스타글란딘 E2 (PGE 2) 9,10왔다. 더 최근에, 수신자 같은 수용체 (TLR) 작용제의 사용은 인기 11,12를 얻고있다. 이 프로토콜에서는, 우물 2 MG / ML Polyinosinic-Polycytidylic 산성 폴리-L-라이신 카르복시 메틸 (폴리 ICLC)를 추가하고 잘 섞는다. 폴리 ICLC 폴리-L-*-라이신 및 카르복시 메틸 셀룰로오스 (Oncovir, 주식 회사에 의해 제조)로 안정화 폴리 IC의 임상 등급 정립이다.
  3. 각 잘 간 경쟁 13을 피하기 위해 단일 펩티드를 받고, 그 지정 우물에 100 ㎍ / ㎖ 긴 펩티드 항원 (NY-ESO-1 및 / 또는 Melan-A/MART-1)를 추가합니다.
  4. 37 접시를 품어 조직 문화 인큐베이터는 5 % CO를 포함 10 ° C <서브> 2 O / N.

6. 7 일 : 수지상 세포의 냉동 보존

  1. 자가 혈장과 10 % DMSO를 사용하여 DC 냉동 솔루션을 준비합니다. 모든 미립자 물질을 제거하기 위해 4 ° C에서 20 분 동안 2,000 DC 냉동 솔루션 × g의 원심 분리기. 새로운 라벨 15 ML 원뿔 튜브에 뜨는을 전송합니다. 4에서 보관 ° 사용까지 C.
  2. 하룻밤 배양이 완료되면, 수확 및 수영장 50 ML 원뿔 튜브에 펩타이드와 펄스 DC가 포함 된 모든 우물.
  3. 6 분 동안 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거합니다. 5 RPMI의 ML / 1 %자가 혈장에있는 세포 펠렛을 resuspend. 최대 RPMI / 1 %자가 플라즈마 50ml로 전체 볼륨을 가져와. 철저하게 섞는다.
  4. 세포의 수를 계산하고 세포 생존을 결정합니다. 가능한 세포의 총 수를 계산합니다.
  5. 상온에서 6 분간 500 × g에서 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 5 ML steri의 각 펠렛을 resuspend을르 0.9 % 염화나트륨, USP 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송. 더 멸균 0.9 % 염화나트륨, USP와 함께 14 ML 각 세포 현탁액을 가져옵니다. 반전에 의한 모자 및 섞는다.
  6. 이전 단계를 두 번 반복합니다. 마지막으로 원심 분리 한 후 펠렛을 방해하지 않고 최대한 가까이 세포 펠렛을 받고, 상층 액을 제거하십시오.
  7. 4시에 DC 냉동 용액에 세포 펠렛을 Resuspend - 20 X 10 6 세포 / 각 1.8 ML의 CryoTube 유리 병에 ML 및 나누어지는 1 ML.
  8. DC 백신의 분주을 동결하고 장기 저장을위한 액체 질소 냉동고의 기상으로 즉시 전송, 제어 속도 냉장고, 프로그램 사용 1.

7. 많은 릴리스 테스트

  1. DC 백신의 각 배치를 평가하고 일반적으로 5~6주 백신 준비 후 연구에서 환자에 주입 해제되기 전에 특정 로트 출하 기준 (표 1)을 만족해야합니다.
  2. 생존 :자동 셀 카운터를 사용하여 DC 백신의 가능성을 평가한다. 최소 허용 가능성 사양> 70 %이다.
  3. 식별 : 유동 세포 계측법에 의해 성숙 수지상 세포 (CD11c + CD14-CD83 +)의 신원을 평가합니다. CD11c의 + 세포의 비율> 75 %이어야한다. CD11c + 및 CD14 + 세포의 비율이되어야합니다 <30 % CD11c의 비율 +, CD14-, 및 CD83 + 세포가 있어야한다> 75 %.
  4. 불임 : 직접 문화 그램 얼룩에 의한 혐기성과 호기성 세균과 곰팡이의 존재에 대한 테스트 DC 백신. 직접 배양 시스템 및 지표 세포주 DNA 형광 염색 분석을 사용하여 마이코 플라스마의 존재를 평가한다. 이러한 테스트의 최소 사양 집합은 성장이 모든 문화에서 관찰되는 것입니다.
  5. 독소 : 운동-QCL 운동 발색 LAL 분석을 사용하여 독소의 내용을 평가하고 최소한의 기준을 충족 <50 EU / ML해야합니다.
  6. 기능 : 동종 T 세포와 함께 배양하여 혼합 림프구 반응 DC 기능을 평가합니다. 자극받지 않은 수지상 세포에 비해 증식의 존재는 (그림 3)보고됩니다.

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결과

10 사이 - 시작 말초 혈액의 20 %는 문화 시대의 끝에서 수지상 세포로 분화. 성숙 수지상 세포는 CD11c 있습니다 +, CD14-, CD83 +, CD40 +, 및 CCR7 + (그림 1). 그들은 MHC 클래스 I 및 II 분자와 보조 자극 분자 CD80 및 CD86의 높은 수준을 표현한다. 다른 TLR 길항제 (14)에 비해 폴리 ICLC는 PDL-1의 낮은 수준을 유도. 또한 이러한 폴리 IC-성숙 수지상 세포 분비 큰 IL-12의 양의 (그림 2, 15,16)과 동종 T 세포 (그림 3)의 확산을 유도.

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토론

단계 I 및 II는 단핵구 유래 수지상 세포의 임상 시험은 환자 그러나 임상 적 성공은 1 제한되었습니다에 면역 반응을 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 종양 immunotherapeutic 사용을위한 최적의 수지상 세포를 생성하는 방법에 대한 합의의 부족으로 인해 부분적으로 할 수 있습니다. 임상 등급 수지상 세포를 생성하는 여러 가지 방법이 있지만,이 방법은 단핵 세포 성숙을 유도하는 데 자극 항원 로딩하는 방법을 구분하는 데 사용되는 사이토 카인의 사용 조건에 따라 다릅니다. 최적의 수지상 세포를 생성하는 수식은 여전히 2 정의 할 수 남아 있습니다.

체외 연구에서 최근의 수지상 세포는 임상 시험의 대부분에 사용 된 염증성 사이토 카인 (10)의 칵테일 성숙 특히 PGE2의 존재가, 규제 T 세포와 Th2 사이토 응답 17, 급행 IDO의 분화를 유도 할 수있는 것으로 나타났습...

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공개 사항

저자는 다음에서 재정 지원을받은 : NIH (AI061684, AI071078, AI044628, 및 K08 AI084578 (밀러)), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 도리스 듀크 자선 재단, 암 연구소, 루퍼스 연구를위한 동맹, 그리고 에메랄드 재단. 니나 Bhardwaj는 자료 및 내성을 조작하는 수지상 세포의 사용과 관련된 특허에 coinventor입니다. 저자는 다른 관련 제휴 나 금융 관심이나 떨어져 개시된에서 원고에서 논의 된 주제 나 자료와 재무 충돌 어떤 조직이나 기업과 금융 참여가 없습니다.

감사의 글

저자는 폴리 ICLC의 선물 안드레스 살라을 (Oncovir, 주식 회사) 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI-1640 배지, L-글루타민포함 BioWhittaker12-702F
1M HEPES 완충 식염수BioWhittaker17-737E
인산염 완충 식염수(PBS)BioWhittaker17-516F
인간 알부민, 25% 용액 USPAventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUMGE Healthcare17-5442-03
Human AB serumValley BiomedicalHP1022
멸균 식염수 USPHospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/mlBerlexA02266
MACS GMP IL-4Miltenyi Biotec170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/mlOncovirNA
VACMUNE KLHBiosyn
225 sq cm EasyFlasksNalgene Nunc159934
Falcon 6웰 조직 배양 플레이트Becton Dickinson353046
1.8 ml CryoTube 바이알Nalgene Nunc377267
Controlled Rate FreezerThermoCryoMed

참고문헌

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