방법 논문

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

DOI:

10.3791/50433

⸱

2013년 5월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

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타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

초록

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여기에서 우리는 등 그 생물 학적 샘플 신진 대사 프로파일을 분석 할 수있는 워크 플로우를 제시, 세포, 혈청, 또는 조직. 샘플을 먼저 액체 - 액체 상 적출에 의해 극성 및 비극성 분획으로 분리하고, 부분적으로 다운 스트림 분석을 용이하게 정제된다. 초기 추출 수용액 (극성 대사 물질) 및 유기 모두 (비 극성 대사 물질) 단계는 대사의 넓은 범위를 조사하기 위해 처리됩니다. 대사는 자신의 파티션 속성에 따라 다른 액체 크로마토 그래피 방법으로 구분됩니다. 이 방법에서는, 우리는 (UP) LC 방법을 마이크로 초 성과를 제시하지만, 프로토콜은 높은 흐름과 낮은 압력으로 확장됩니다. 질량 분석기에 도입 일반 또는 화합물 최적화 된 소스 조건 중 하나를 할 수 있습니다. 이온의 넓은 범위의 검출은 최근 C에 높은 해상도를 사용하여 광범위한 m / Z 범위에서 긍정적이고 부정적인 모드에서 전체 스캔 모드에서 수행됩니다악기를 alibrated. 레이블 무료 차동 분석은 생물 정보학 플랫폼에서 수행됩니다. 이 방법의 응용 프로그램은 대사 경로 검사, biomarker 발견과 약물 개발이 (가) 있습니다.

서론

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HRMS 분야의 최근 기술 발전으로 인해, 타겟이 불분명 한, 가설 생성 대사 접근은 복잡한 시료의 분석 가능한 방법이되고 있습니다. 백만 루틴 낮은 부분을 촉진 100,000 해상도 (PPM)의 질량 정확도 수 1 질량 분석기 널리되고있다 여러 공급 업체에서 제공. 2,3이 질량 정확도는 더 특이 분석의 정체성, 동위 원소 패턴 인식, 내전 식별의 예비 할당에 대한 신뢰하실 수 있습니다. 4 적절한 추출 절차 및 고성능 LC 또는 UPLC, 복잡한 혼합물과 결합 할 때 유지 시간 데이터에서 파생 된 추가 특이성 분석 할 수 있습니다. 5 UPLC 더 큰 크로마토 그래피의 효율성을 소유하고 그 결과 큰 데이터 집합이 어떤에 통합 될 수있는 가능한 대사 체 6.의 큰 범위를 만드는 민감도, 해상도 및 분석 시간을 허용여러 개의 차동 분석 소프트웨어 및 유용한 패턴이나 관심의 개별 분석을 위해 채굴. 7,8,9,10,11 상상 속 히트 곡이 처음 피크 검출 알고리즘의 조합, 정확한 질량 기반의 화학 수식 예측, 조각 예측을 사용하여 식별 할 수있는, 그리고 화학 데이터베이스 검색을. 이 방법은 수 시간이 소요되는 전체 구조 식별을 위해 또는 더 민감하고 더 구체적인 안정 동위 ....

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프로토콜

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1. 세포 시료 전처리

  1. 세포의 10 센티미터 플레이트 : 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 미디어 해제 세포 현탁액의 1.5 ML를 수집합니다. 접착 라인의 경우, 세포는 얼음에 보관 매체의 1.5 ML에 부드러운된다고으로 해제해야합니다 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다.
    코멘트 : 세포 대사의 담금질 특정 대사 산물 중요합니다. 시간에 민감한 대사 산물의 분석을 위해, 같은 차가운 메탄올 추출 등의 절차가 고려되어야한다. 17
  2. 샘플을 포함하는 10 ML 유리 튜브에 각각 6 클로로포름 ML (CHCl 3) / 메탄올 (CH 3 OH) (2:1 V / V)를 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다. 흔들어 후, 샘플은 4에서 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 원심 분리 ° C 완전히 단계를 분리 할 수​​ 있습니다.
    선택 : CHCl 3 사용하지 않으려면, 추출은 (CH 2 망할 CIA 2) 디클로로 메탄으로 수행 ....

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결과

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제시된 결과는 농약과 미토콘드리아 복잡한 I 억제제 로테 논을 가진 SH-SY5Y 아교 모세포종 세포의 6 시간 처리에서 선택된 데이터를 보여줍니다. 간결 만 유기 상 긍정적 인 모드 데이터가 표시됩니다. 샘플을 처리하고 위에서 설명한대로 분석 (그림 1, 표 1, 표 2)와 레이블이없는 정량 SIEVE 및 XCMS 온라인으로 두 개의 차동 분석 플랫폼에 탑재되었다. 조회수 많은 수의 (그림 2, 그림 3) 차동 분석에 사용되는 두 개의 프로그램으로 식별되지만 이러한 기능은 가능성 유물, 제대로 통합 봉우리, 그리고 의심 분석 값의 다른 기능이 포함되어 있습니다. 이것은 적절한 신호 강도, 같은 그룹의 샘플 배경 수준, 좋은 크로마토 그래피 피크 모양 (그림 3)과 낮은 변동에 대한 안타를 심사하여 판단 할 수 있습니다.

downstre을 보여초기 히트의 확인입니다, 우리는 3 ppm으.......

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토론

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타겟이 불분명 한 대사는 내인성 또는 생체이 biotransformations을 조사하거나, 그 샘플의 대사 프로파일을 캡처하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 해상도와 감도, 생성 된 대용량 데이터를 처리 할 수있는 능력을 샘플을 분리하고 분석하는 데 사용되는 기술과 유용한 정보 (예 : 정확한 질량 데이터베이스 검색)에 대한 데이터 집합을 채굴 할 수있는 능력을 가진 기술 저울의 출력. 최근, 이것은 고해상도 질량 분석기의 발전에 의해 촉진, 고 또는 초 고성능 액체 크로마토 그래피되었습니다. 차동 분석 소프트웨어는 분석 병목 현상을 해결하고 있으며, 적절한 정보학 파이프 라인의 높은 처리량. 20,21,22 선택과 유지 시간 교대, 필터링 및 통계 분석을위한 피크 검출 조정을 수행 할 수있는 것은, 알고리즘을 centroiding 데이터와 같은 고려 사항을 포함해야 피크 탐지, 첨단 통합, alignmenT, MS / MS 데이터를 통합 할 수있는 능력, 그리고 동위 원소 또는 부가 물을.......

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 5T32GM008076의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 SIEVE 2.0 및 박사 부부에 액세스하기 위해 온도 과학을 감사합니다. 유용한 토론 유진 Ciccimaro 및 온도 과학의 마크 샌더스.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약
phosphate 완충 식염수Mediatech21-031-CM
물(H2O)Fisher ScientificW7-4(최적)
아세토니트릴(CH3CN)Fisher ScientificA996-4(최적)
메탄올(CH3OH)Fisher ScientificA454-4(optima)
IsopropanolFisher ScientificA464-4(optima)
클로로포름(CH3Cl)Sigma-Aldrich366927Hazard
Dichloromethane(CH2Cl2)Acros Organics61030-1000클로로포름
Diethyl EtherSigma-Aldrich를 대체하려면346136클로로포름
포름산 (FA)Fisher Scientific(optima)
NH4OHFisher ScientificA470-250(optima)
포름산암모늄(HCOONH4)Sigma-Aldrich78314
MicroSpin C18 컬럼Nest Group IncSS18V
파스퇴르 피펫Fisher Scientific13-678-200
10 ml 유리 원심분리기 튜브Kimble Chase73785-10
10 ml 플라스틱 원심분리기 튜브CellTreatCLS-4301-015
LC 바이알 (유리)Waters60000751CV
LC 인서트 (유리)WatersWAT094171
LC 바이알 (플라스틱)Waters
0.22 μ m 필터Corning8169나일론
2ml Eppendorf TubesBioExpressC-3229-1Low Retention
Equipment
High Resolution Mass SpectrometerThermo ScientificLTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLCWatersnanoACQUITY UPLC
SourceMichromThermo 고급 소스
차등 분석 소프트웨어Thermo ScientificSIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μ M 입자 크기, 150 mm x 100 μ m
Acentis Express C8시그마-알드리치542622.7 μ M 입자 크기, 15cm x 200 μ 중
을 대체하려면186002640

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
  2. Makarov, A., Denisov, E., et al.

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재인쇄 및 허가

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