방법 논문

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

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DOI:

10.3791/50561

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2014년 1월 6일

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1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

이 논문에서

요약

합성 면역 능력 호스트에서 평가, 암 줄기 세포 (CSC) 기반 수지상 세포 (DC) 백신은 이질 적인 대량 종양 세포와 펄스 전통적인 DC 백신 보다 상당히 높은 항 종양 면역을 입증.

초록

우리는 암 줄기 세포 (CSC)-농축 된 인구는 Murine 흑색종 D5 합성C5/6 마우스와 편평상피암 SCC7 합성을 알데플루OR/ALDH를 마커로 사용하여 C3H 마우스에 합성, 맥박 세포에 항원 용액의 소스로 세포 용해성을 테스트 (DCs). ALDH높은 CSC lysates와 펄스 된 DC는 모델 과 폐 전이 설정 및 s.c 모두에서 분류되지 않은 전체 종양 세포 리스의 lysates로 펄스 DC보다 훨씬 더 높은 보호 항종양 면역을 유도한다. 종양 성장 설정, 각각. 이 현상은 CSC 백신 유도 된 유머뿐만 아니라 세포 항 CSC 반응 때문이었다. 특히, CSC-DC 백신을 실시하는 호스트로부터 분리된 비장세포는 분류되지 않은 종양 세포 용해 펄스-DC 백신을 실시하는 숙주로부터 분리된 비장세포보다 훨씬 더 많은 양의 IFNγ 및 GM-CSF를 생산하였다. 이러한 결과는 보조 제 환경에서 임상 사용을 위한 자가 CSC 기반 치료 백신을 개발하는 노력을 지원합니다.

서론

암 줄기세포는 종래의 화학요법 및 방사선 요법에 상대적으로 저항력이있다 1,2. 한편, 세포의 이 인구는 전통적인 암 치료1-4후에 암의 재발 그리고 진행을 책임지는 세포일지도 모릅니다. 암 줄기 세포에 분화 한 종양 항원의 발현의 부족으로 인해, 암 줄기 세포는 주로 분화 된 종양 세포에 항원을 대상으로 설계 암에 대한 치료의 현재 면역 학적 개입을 탈출 할 수있다. 따라서, 암줄기세포를 구체적으로 표적으로 하고 파괴하는 새로운 전략의 개발은 현재암 치료의 치료 효능을 증가시키는 약속을 지킬 수 있다. 이를 위해, 우리는 2개의 동물종양 (흑색종 D5 및 편평세포 암 SCC7)에서 암 줄기 세포 (CSC)를 풍부하게 한 인구를 격리하고, CSC-TPDC 백신을 준비하기 위하여 항원 제시 세포 (수지상 세포, DC)를 펄스하는 항원 근원으로 이용했습니다. 그런 다음 합성 면역 능력 호스트, B6 마우스 및 C3H 마우스에서 CSC-TPDC 백신에 의해 유도된 항종양 면역을 각각 평가하였다. CSC-TPDC 유도 항종양 효능은 이전에 우리 그룹5,6에서사용되어 온 분류되지 않은 이질성 종양 세포(H-TPDC)로부터 용액으로 펄스된 기존의 DC 백신과 비교되었으며, 다른조사자들(7)은 전임상 연구와 임상 시험 모두에서 비교하였다.

프로토콜

1. 알데플루어 염색

  1. 세포 샘플 준비: 배양된 종양 세포 또는 갓 수확한 종양 샘플에서 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포를 계산하고 ALDEfluOR 분석 버퍼에서 1 x 106 세포/ml의 농도로 세포 현탁액을 조정합니다.
  2. 다음과 같이 컨트롤 튜브로 4 개의 12mm x 75mm 폴리스티렌 테스트 튜브라벨 : #1: 알데플루오르 #2, #3: ALDEFLUOR 플러스 DEAB, 및 #4: 7AAD.
  3. 이러한 제어 튜브의 경우 1ml 셀 서스펜션을 #1 #4 넣고 튜브 #2 2ml를 넣습니다. 튜브 #3 5 μl DEAB (ALDH 억제제)를 추가하고 얼음을 유지합니다. 그런 다음 10 μl 활성 ALDEfluOR 기판을 튜브 #2 넣고 혼합물 1ml를 튜브 #3 즉시 전달합니다.
  4. 동시에, 알데플루오 분석 버퍼에서 1 x 106 세포/ml에서 나머지 세포(샘플 튜브)에 백만 세포당 2μl 활성 ALDEFLUOR 기판을 추가합니다.
  5. 37°C 수조에서 30분 동안 4개의 제어 튜브와 샘플 튜브를 모두 배양합니다.
  6. 인큐베이션에 따라, 제어 관 #4 5 μl 7AAD를 추가하고, 샘플 튜브에 1 μl 7AAD 1 x 106 세포를 추가합니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
  7. 원심 분리기는 250 x g에서 5 분 동안 모든 튜브를 제거하고 상류체를 제거합니다.
  8. 알데플루오 분석 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.
  9. 유동 세포측정 기반 정렬을 수행합니다.
  10. DEAB로 처리된 ALDEFLUOR-스테인드 세포를 사용하여 선별 게이트를 음의 대조군으로 설정하고 생존 가능성을 조절하기 위해 프로피듐 요오드(PI) 7AAD-스테인드 셀을 설정합니다. 이러한 컨트롤에 기초하여, ALDEFLUOR+/ALDH높은,D5 및 SCC7 세포를 구별하기 위해 게이트가 설치되었다. 이러한 게이트는 ALDEFLUOR+/ALDH높은 D5 및 SCC7 세포를 위해 위에서 준비된 모든 샘플 세포를 정렬하는 데 사용됩니다.

2. 암 줄기 세포 용해 성 수지상 세포 (CSC-TPDC) 백신 의 준비

  1. CO2 및 상립 대퇴골 및 경골 뼈를 사용하여 마우스 (syngeneic B6 및 C3H, 각각)를 안락사시합니다.
  2. 실온에서 1 분 동안 75 % 에탄올에 뼈를 넣습니다. 그런 다음 HBSS를 사용하여 뼈를 씻으시면 됩니다.
  3. 뼈를 잘라 내고 21 G 바늘과 10ml 주사기를 사용하여 세포를 접시에 밀어 넣습니다.
  4. 주사기를 사용하여 세포를 흡인시키고 날려 단일 세포 현탁액을 만듭니다.
  5. 원심분리 후 1,500rpm에서 5분 동안, 상체를 폐기하십시오. 그런 다음 RBC 용해 버퍼 5ml를 추가하여 37°C 수조에서 1분 동안 RBC를 용해합니다.
  6. 셀 수를 카운트하고 10 ng/ml GM-CSF 및 10 ng/ml IL-4를 포함하는 완전한 매체(CM)에서 1백만 개의 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 조절한다.
  7. 세포를 배양하고 CM 플러스 IL-4 및 GM-CSF를 3 일 후에 보상합니다.
  8. 5일째에는 미숙한 수지상 세포(DC)를 수확하고 4.2ml 용액 C+ 1ml OptiPrep 밀도 그라데이션 배지를 함유한 DC 절연 배지를 준비한다.
  9. 5ml CM의 세포 펠릿을 중단합니다. 셀 서스펜션을 격리 배지에 천천히 넣습니다. 실온에서 2,000 rpm의 원심분리기.
  10. CM과 격리 매체 사이에 DC를 수집합니다. 셀 수를 카운트하고 10 ng/ml GM-CSF 및 10 ng/ml IL-4를 포함하는 배양 배지에서 1백만 개의 세포/ml 농도로 세포 현탁액을 조절한다.
  11. 배양 배지에서 ALDH높거나 정렬되지 않은 D5 또는 SCC7 세포를 일시 중단하고 급속동결 해동 노출에 4회 인하여 종양 용액을 준비한 다음 5분 동안 ~100 x g에서 스핀을 하여 용액의 막 부분을 수집한다.
  12. CSC-TPDC를 준비하려면 자가 알DH고세포의 용액으로 DC를 펄스합니다. H-TPDC를 준비하려면 분류되지 않은 이질성 종양 세포용재로 DC를 펄스합니다. DC와 종양 세포 리스의 비율은 동일합니다.

3. 예방 접종 및 효능 평가

  1. 2,500D5 CSC-TPDC 또는 D5 H-TPDC 종양 세포를 피하(s.c)로 각각 정상 B6 마우스를 예방접종한다. 5,000 SCC7 CSC-TPDC 또는 SCC7 H-TPDC 종양 세포를 각각 접종하여 정상 C3H 동물 s.c.
  2. 예방 접종 후, 이질D5 종양 세포 i.v. CO20 일 후 CO를 사용하여 마우스를 안락사시키는 이질D5 종양 세포로 B6 마우스에 도전하십시오. 폐를 수확하고 폐 전이를 예추합니다.
  3. SCC7 모델에서, DC 백신의 반대편에 .c 분류되지 않은 SCC7 종양 세포로 C3H 마우스에 도전한다. 종양 크기를 모니터링합니다.
  4. 실험이 끝나면 CO2를사용하여 B6 및 C3H 마우스를 안락사시한다. 첫 번째 백신 후 34 일째에, CO2로마우스를 안락사시키고 동시에 무균 시술로 각 그룹의 비장을 수집합니다.
  5. 고동된 안티 CD3 플러스 hrIL-2 또는 LPS 플러스 안티 CD40 (FGK45) mAb 배분을 포함하는 CM에서 안티 CD28 mAbs와 비장 T 및 / 또는 B 세포를 활성화합니다.
  6. 활성화 후, 슈퍼 나츠퍼를 수집하고 ELISA 분석에 사용합니다.
  7. ELISA 분석의 경우, 4°C O/N에서 IFNγ, GM-CSF 및 IgG용 항체를 가진 코트 플레이트.
  8. 차단 버퍼를 적용한 후 샘플 및 표준을 추가하고 실온에서 배양합니다.
  9. 플레이트를 세척하고 인큐베이션을 위해 HRP 검출 항체 및 TMB 기판을 추가합니다.
  10. 반응을 중지한 후 30분 이내에 450nm에서 ELISA 플레이트 판독기의 흡광도를 측정합니다.

결과

ALDEFLUOR/ALDH는 다중 악성 종양에서 줄기 세포를 분리하는 단일 마커로서 사용되어왔다 8-11. 우리는 알데플루어를 마커로 사용하여 2개의 종양 모형 D5 및 SCC7에 있는 암 줄기 세포 농축인구를 확인했습니다. 우리는 뮤린 흑색종 B16-D5및 편평상피 세포암 SCC7에 있는 ALDEfluOR+ 세포를 검출했습니다. 우리는 ALDEFLUOR+ 세포가 배양D5 및 SCC7 종양 세포주에서 각각 약 0.5% 및 5.2%를 기여한다는 것을 것을을 발견했습니다(그림 1). 확립된 종양에서 갓 수확한 종양 세포는 ALDEFLUOR+ 세포의 존재를 확인하기 위해 분석되었다. 도 1에도와 같이, 생체 내에서 ALDEfluOR+ 세포의 2.5% 및 4.2%가 각각 D5 및 SCC7 종양을 확립하였다. 이들 선별된 D5 및 SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH높은 집단의 종양성 및 자체 갱신 능력은 각각8개의합성 면역능력 숙주에서 평가되었다.

우리는 동물 연구 와 임상 시험 에서 모두 MC (H-TPDC)를 펄스하기 위해 이질성 무분류 종양 세포 용액을 사용하였다5,6. CSC의 면역원성을 조사하기 위해, 우리는 CSC-TPDC(그림 2)를생성하기 위해 CSC의 용액으로 ALDH높은 CSC 및 펄스 DC를 분리하고 CSC-TPDC가 종양 성장을 방지하는 데 유익한 효과가 있는지 테스트하기 위해 종래의 암 백신 제어로 H-TPDC를 사용했습니다.

우리는 CSC-TPDC에 의해 유도된 보호 항종양 면역을 검토해서 CSC의 면역원성을 평가했습니다. D5 모델에서, 순진한 면역 무능마우스는 CSC-TPDC 또는 H-TPDC (동일 lysate에서: DC 비율)를 가진 s.c 백신 접종을 했습니다. 제어 그룹은 식염수(PBS)를 받았습니다. 마지막 백신 후 1 주일, 마우스는 정맥으로 분류되지 않은 D5 종양 세포(즉,v.)로도전하고 폐는 폐 전이를 예매하기 위해 3 주 후에 수확되었다. 표 1에도시된 바와 같이, PBS 그룹과 비교하여, H-TPDC로 처리된 마우스는 더 적은 폐 전이를 개발하였다. 중요한 것은, CSC-TPDC로 처리된 마우스는 두 실험에서 H-TPDC 백신 단보다는 훨씬 적은 폐 전이가 있었습니다. SCC7 모델에서 정상적인 C3H 동물.c은 SCC7 CSC-TPDC 또는 H-TPDC를 각각 오른쪽 측면에 접종한 후, 분류되지 않은 SCC7 종양 세포s.c 좌측으로 도전하였다. PBS 그룹과 비교하여 H-TPDC는 종양 성장에 대한 겸손한 항종양 면역을 유도했습니다. 그러나, 대조군 및 H-TPDC 군(p<0.05, 도 3)과 비교했을 때 CSC-TPDC로 치료된 마우스에서 종양 성장의 현저한 억제가있었다. 이러한 결과는 CSC가 종양 세포의 도전에 대한 보호 면역을 유도하는 전통적인 분류되지 않은 종양 세포보다 DC를 로드하는 보다 효과적인 항원 소스로 사용될 수 있음을 나타냅니다.

관찰된 CSC 유도 된 보호 항종양 면역의 기본 메커니즘을 더 이해하기 위해 실험이 끝날 때 DC 예방 접종을 받는 동물로부터 비장을 수확했습니다. 비장 세포는 그 때 반대로 CD3/CD28/IL-2 또는 반대로 CD3/CD28/IL-2 + LPS/안티 CD40에 의해 활성화되었다. 이어서 배양 슈퍼나탈이 수집되어 사이토카인 및 항체의 발현을 검출했다.  D5 CSC-TPDC 또는 SCC7 CSC-TPDC(도 4)로 예방 접종된 동물로부터 비장 세포에 의해 IFNγ 및 GM-CSF의생산량이상당히 높았다. 더욱이, D5 CSC-TPDC 또는 SCC7 H-TPDC와 비교하여 D5 CSC-TPDC 또는 SCC7 CSC-TPDC로 예방 접종된 동물로부터 수집된 LPS/안티 CD40 활성화 비장 세포에 의한 IgG 생산량이 현저히(p<0.05) 높았다. 이들 항체는 각각 D5 및 SCC7 CSC에 결합하는 것으로 나타났으며, 이러한 결합은 보완8의존재속에서 CSC 리시스를 초래할 수 있다.

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그림 1. ALDHFLUOR+/ALDH높은 인구는 새로 수확된 신선한 뮤린 D5 흑색종 및 SCC7 편평상피 세포 종양뿐만 아니라 배양에서 검출되었다. 50mmol/L DEAB로 처리된 종양 세포는 특정 ALDH 억제제로서, 음성 대조군으로 사용되었다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 

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그림 2. 수지상 세포 기반 암 줄기 세포 백신의 생성. CSC-TPDC 및 H-TPDC의 제조를 위해, 골수 유래 수지상 세포는 각각 ALDH높거나 분류되지 않은 종양 세포 용액으로 펄스되었다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 

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그림 3. CSC 용해 펄스 DC (CSC-TPDC) 백신은 s.c에서 보다 효과적인 보호 항종양 면역을 유도할 수 있었습니다. SCC7 종양 모델. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 

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그림 4. CSC-TPDC로 예방 접종된 면역 능력 호스트에서 보다 강력한 전신 세포 반응.  비장세포는 H-TPDC 또는 CSC-TPDC 예방 접종을 받은 동물로부터 수확되었으며, 표시된 대로 활성화되었다. 배양 슈퍼넌트는 ELISA를 사용하여 사이토카인 검출을 위해 수집되었다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. 

토론

SCID 마우스와 같은 면역 손상된 호스트는 호스트 내의 적응성 면역의 부족으로 인해 CSC의 면역 학적 평가를 배제합니다. 이 연구에서는, 우리는 면역 무능한 호스트에 있는 CSCs의 면역genicity를 평가했습니다, 이는 환자 설정을 더 밀접하게 모방할 수 있었습니다. 농축 된 CSC는 면역 원소이며 선택되지 않은 종양 세포 용해 성 DC에 비해 백신으로 그들의 lysates가 DC에 로드될 때 보다 효과적인 종양 보호 면역을 유도할 수 있습니다.  기계적으로, 보호는 CSC 반응성 항체 및 T 세포8의 선택적 유도뿐만 아니라 IFNγ 및 GM-CSF와 같은 타입-1 사이토카인의 생산에 의해 부여되었다.

수지상 세포 기반 백신 및 입양 T 세포 전달을 포함한 현재 면역 요법의 대부분은 종양-분화 항원들을 표적으로 하기 위해 고안되었습니다. 이러한 분화된 항원들을 발현하지 않을 수 있는 CSCs는 그러므로 이러한 면역학적 표적을 피할 수 있다. 대조적으로, 암줄기세포를 구체적으로 표적으로 하기 위하여 설계된 CSC 백신은 암세포의 이 특별한 인구를 파괴하고, 따라서 종양 재발 및 전이를 방지해서 백신의 치료 효험을 향상시킬 수 있다.

배양된 종양 세포와 갓 수확한 종양 모두에서, 우리는 높은 알데히드 탈수소 효소 활성에 기초한 혈류 세포측정에 의하여 CSC 농축 인구를 확인했습니다. 이러한 ALDH고세포는 CSC-TPDC를 생성하는 CC-TPDC를 생성하는 항원 소스로 사용되는 흐름 분류에 의해 단화될 수있다. 이 결과는 배양된 종양 세포에서 또는 임상 신청을 위한 갓 수확한 종양에서 고립된 CS를 사용하는 잠재력을 밝혔습니다.

임상적으로 관련성이 있기 위해서는 치료 환경에서 백신을 검사해야 합니다. 이 실험은 지금 우리의 실험실에서 수행되고 있습니다.

공개 사항

STEMCELL Technologies는 오픈 액세스 게시 수수료를 지원했습니다.

감사의 글

이 작품은 미시간 대학 종합 암 센터의 윌과 Jeanne Caldwell 부여 연구 기금에 의해 지원되었다 부분적으로 NIH 보조금 CA82529 및 길슨 Longenbaugh 재단에 의해.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ALDHEFLOUR KITStemcell Technologies1700
Murine IL-4Pepro Tech214-14
Murine GM-CSFPepro Tech315-03
마우스 GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep 밀도 구배 매체시그마 AldrichD1556
BD OptEIA TMB 기질 시약 세트BD Biosciences555214
장비
BD FACS Aria 세포 분류기BD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek 기기176058

참고문헌

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