역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

요약

우리는 순차적으로 온 - 칩 bioorthogonal 사이클로 화학 및 항체 - 항원 캡처를 사용하여 작은 분자의 빠른 가역적 고정화 및 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 연구를위한 기능화 나노 입자 어셈블리에 대한 방법을 제시한다.

초록

방향과 고정 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 빠른 표면 고정화하는 방법은 바이오 센서 및 마이크로 어레이 응용 프로그램에 매우 바람직하다. 이 연구에서, 우리는 TCO / TZ-유도체 분자의 미세 고정을 가능하게하는 매우 효율적인 공유 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)를 사용 . 우리는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 연속적인 유동 조건에서 실시간으로 프로세스를 모니터링한다. 리버시블 고정화를 활성화 센서 표면의 실험 범위를 확장하기 위해, 우리는 고리 화 반응과 비공유 항원 항체 캡처 컴포넌트를 배합. 교대 센서 표면에 TCO 또는 Tz 일 잔기를 제시함으로써, 다 캡처-사이클로 공정은 다 성분 다양한 구조의 온 - 칩 어셈블리와 상호 작용 연구를 위해 하나의 센서면에 지금은 가능하다. 우리 나작은 분자, FK506 결합 단백질 12 (FKBP12)를 결합 AP1497, 2 개의 바이오 센서 칩에 다른 고정화 실험으로이 방법을 llustrate과 같은 작은 분자 고정화에 현장 기능화 나노 입자의 일환으로.

서론

효율적인 결합 반응은 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 표면에 생체 활성 분자를 연결하는 중요한 도구입니다. 최근 매우 빠른 bioorthogonal 트랜스 - 옥텐 (TCO) 사이 [4 +2] 고리 화 반응 및 1,2,4,5 - 테트라 (Tz 일)은 세포 표면, 세포 내 구조, 항체 및 나노 입자를 레이블로 사용 된 ^{1. -} 여기에 ^7, 우리는 표면 플라스 몬 공명 (SPR)의 상호 작용 분석을위한 다 성분 구조의 가역적 인 온 - 칩 합성 항원 / 항체 캡처 (GST / 안티 GST)와 함께 [4 +2] 고리 화 반응을 사용하여 모니터 실시간 프로세스 (그림 1). 새로운 분석의 다양한 리간드의 방향과 밀도를 제어 안정 센서 표면의 결과, 어셈블리로 ^8,9 특히, 캡처 - 사이클로 전략 수립 프로토콜을 사용하여 표면의 재생을 가능하게한다. ⁸ 형식은 지금 가능합니다. 사용이 전략은 우리는 TCO / TZ-유도 된 작은 분자의 고정화를 설명하고 버퍼 다양한 조건에서 사이클로 속도를 특징. 우리는 직접 고정 된 GST 항원에 부착 할 때 캡처 - 사이클로 전략 목표와 상호 작용하는 작은 분자의 기능을 유지하는지 확인하기 위해 예를 들어 FKBP12 ^10-12....

프로토콜

1. GST 및 나노 입자 (NP) 결합체의 제조

1. GST-TCO 준비 :
   1. GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 100 μL로 TCO-NHS 솔루션의 8 μL (DMSO에 50 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
   2. Zeba 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 과량의 시약을 제거합니다. GST-TCO 복합체를 포함하는 복구 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다.
2. GST-는 TZ 준비 :
   1. GST (PBS에 1 ㎎ / ㎖)의 75 μL에 TZ-NHS 용액을 6 μL (DMF 25 mm)를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어.
   2. PBS 25 μL로 반응 혼합물을 희석하고 스핀 탈염 컬럼을 사용하여 정제. GST-는 TZ 접합체를 포함하는 여과 액을 사용하기 전에 4 ° C에 저장됩니다.
   참고 : 질량 분석 (MALDI-TOF)이 평균 10 ~ Tz 일 또는 TCO 분자가 GST에 접합 된 것으로 나타났다.
3. NP-TCO 준비 :
   1. 에 TCO-NHS 용액 100 μL (DMSO에 50 mm)를 추가150 아미 노화 나노 입자 (NP-NH _2, PBS....

결과

데이터 및 수치는 기준 8에서 적응되었습니다.

방향과 밀도 제어와 생체 활성 작은 ​​분자의 효율적인 가역 고정 새로운 바이오 센서의 응용 프로그램의 개발에 핵심적인 역할을 담당하고 있습니다. TCO와 Tz 일 사이 빠른 bioorthogonal 반응을 이용하여, 우리는 단계적 어셈블리 및 생물학적 활성의 유지와 리간드 표면의 재생을위한 방법을 설명한다. 2 _TZ-BnNH이 고정화의 실시간 모니터링을 나타낸 것이다. GST-TCO의 용액 님 ~ 400 RU 상승의 결과 미리 고정화 된 항-GST 표면 위에 분사된다. TZ-BnNH ₂ 번째 주사는 응답 빠르고 ~ 15 RU 상승을 보여줍니다. 유도 된 항원의 어떠한 해리는 구조 안정성에 대한 증거를 제공하는 버퍼를 실행으로 전환 한 후 관찰되지 않습니다. 표면은 다수의 캡처-사이클로 사이클을 활성화 사이클의 마지막 단계에서 재생.......

토론

여기에 설명 된 캡처 - 사이클로 방법은 라벨이없는 칩 기반의 상호 작용과 운동 연구에 대한 수정 된 나노 입자와 작은 분자의 빠른 가역적 고정 할 수 있습니다. 고정화 프로토콜 <저분자 리간드 10 μM 농도가 필요한 분에서 수행 될 수있다. 리간드 농도 및 접촉 시간 고정화 밀도를 변조함으로써 가깝게 제어 할 수있다. 우리의 데이타는 온칩 bioorthogonal 반응 그들의 표적과 상호 작용하는 동일계 기능화 된 나노 입자 또는 고정화 작은 분자의 능력을 보존하는 것을 보여준다. 우리는 또한 낮은 분자량이 작은 분자, (TCO와 Tz 일) 사이에 이분자 사이클로 속도를 특징으로하고 있습니다. 우리는 유사한 분석이 다른 빠른 bioorthogonal 반응의 속도를 측정하고 비교하기 위해 수행 할 수있는 상상.

뒤집을 수있는, 지속적인 흐름 온칩 나노 입자의 고정화 및 원위치 작용 홍보ovides 모든 정화, 고정 및 검사에 대한 여러 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약
센서 칩 CM5	GE 헬스케어	BR-1005-30
아민 커플링 키트	GE 헬스케어	BR-1000-50
GST 캡처 키트	GE Healthcare	BR-1002-23
NAP-10 열	GE 헬스케어	17-0854-01
GST, 동결건조된 1X PBS	Genscript	Z02039	1 mg/ml
rhFKBP12	R& D 시스템	3777-FK
계면활성제 P-20	GE 헬스케어	BR-1000-54
글리신 2.0	GE 헬스케어	BR-1003-55
Zeba 스핀 탈염 컬럼	Thermo	89882	7 K MWCO
Amicon Ultra 4	Fisher	UFC810096	100 K 원심 필터
TCO-OH	Ref. 8		Synthesized in-house
TCO-NHS	Ref. 8		Synthesized in-house, *Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2	Ref. 8		사내에서 합성한
Tz-NHS	Ref. 8	764701	Synthesized in-house, *Commercially Available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2	Ref. 8		Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz	Ref. 8		Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor	GE 헬스케어	비아코어 T100

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