Denne protokollen beskriver en microfabrication-kompatibel metode for celle mønster på SiO 2. En forhåndsdefinert parylene-C design er photolithographically trykt på SiO 2 wafere. Etter inkubasjon med serum (eller annen aktivisering løsning) celler holder seg spesifikt til (og vokse i henhold til konformitet) underliggende parylene-C, mens blir frastøtt av SiO 2 regioner.
Cell mønster plattformer støtter brede forsknings mål, som for eksempel bygging av forhåndsdefinerte in vitro nevrale nettverk og utforskningen av visse sentrale aspekter av cellulær fysiologi. For enkelt å kombinere celle mønster med Multi-elektrode Arrays (Meås) og silisium-basert 'lab on a chip "teknologier, kreves en microfabrication-kompatibel protokoll. Vi beskriver en metode som benytter utfelling av polymeren parylene-C på SiO 세스 skiver. Fotolitografi muliggjør nøyaktig og pålitelig fordelingen av parylene-C ved micron-nivå oppløsning. Påfølgende aktivering ved nedsenkning i føtalt bovint serum (eller en annen spesifikk aktiveringsløsning) resulterer i et substrat hvor dyrkede celler holder seg til, eller blir forhindret av, parylene eller SiO 세스 regioner respektivt. Denne teknikken har tillatt fordelingen av et bredt spekter av celletyper (inkludert primær murine hippocampus celler, HEK 293 cellelinje, menneskelig nevron lignende teratocarcinomacellelinje, primære murine cerebellare granule-celler og primære humane glioma-avledede stamceller lignende celler). Interessant nok er imidlertid plattformen ikke universell; reflekterer betydningen av celle-spesifikke adhesjonsmolekyler. Denne cellen mønster prosessen er kostnadseffektivt, pålitelig, og viktigere kan bli innlemmet i standard microfabrication (chip produksjon) protokoller, som banet veien for integrering av mikroelektroniske teknologi.
Forstå mekanismene som styrer celle adhesjon og mønster på syntetiske materialer er viktig for applikasjoner som tissue engineering, medisiner, og fabrikasjon av biosensorer 1-3. Mange teknikker er tilgjengelige og utvikling, hver tar nytte av de utallige biologiske, kjemiske og fysiske faktorer som påvirker celle adhesjon.
Her beskriver vi en celle-mønster teknikk som utnytter prosessene opprinnelig utviklet for mikrofabrikasjonsformål. Som sådan, er plattformen godt plassert for å muliggjøre nedstrøms integrasjon av mikroelektroniske teknologi, for eksempel MEAs, inn i mønster plattformen.
Grensesnittet mellom en cellemembran og et tilstøtende materiale som er toveis og kompleks. In vivo, ekstracellulære matriksproteiner gi struktur og styrke og innvirkning på celle atferd via interaksjon med celle adhesjonsreseptorer. Tilsvarende celler i vitro samhandle med syntetiske substrater via absorbert lag av proteiner fire mens fysisk-kjemiske påvirkninger også modulere vedheft. For eksempel kan en polymer overflate gjøres mer "fuktbare" (hydrofile) med ioner eller ultrafiolett lys-bestråling, eller etsing ved behandling med syre eller hydroksyd 5. Etablerte metoder for celle mønster dra nytte av disse og andre celle adhesjon meklere. Eksempler inkluderer inkjet utskrift 6, microcontact stempling 7, fysisk immobilisering 8, MicroFluidics 9, sanntidsmanipulering 10, og selektiv molekylær montering mønster (SMAP) 11. Alle har spesifikke fordeler og begrensninger. En viktig pådriver i arbeidet vårt, derimot, er å integrere celle mønster med mikroelektromekaniske systemer (MEMS).
MEMS referere til ekstremt små mekaniske innretninger drevet av elektrisitet. Dette overlapper med nanoskala tilsvarende, nanoelectromechanical systemer. Dette konseptet ble praktisk bare når halvlederstrategier aktivert fabrikasjon å finne sted på mikroskala. Microfabrication teknikker utviklet opprinnelig for halvleder-elektronikk uforvarende blitt funnet nyttig for andre formål som for eksempel celleelektrofysiologi, f.eks. En sentral nedstrøms Målet er å kombinere slike mikroelektroniske teknologi med en high fidelity celle mønster prosessen (danner en BioMEMS enhet). Flere eksisterende og ellers pålitelige og praktiske celle-mønster teknikker er uforenlig med denne ideen. For eksempel er nøyaktig innretting av eventuelle innebygde mikroelektronikk eller biosensorer grunnleggende for deres effekt, men er ekstremt vanskelig å oppnå ved hjelp av en teknikk slik som microcontact stempling.
For å omgå dette problemet, jobber vi med en SiO 2-basert mønster plattform som bruker photolithographically trykt parylene-C. Fotolitografi innebærer overføring av geometriske funksjoner fraen maske til et substrat via UV-belysning. En maske er laget ved hjelp av en passende dataassistert design program. Når en glassplate, et tynt lag av ikke-transparent krom representerer den ønskede geometriske mønster (en funksjon oppløsning på 1-2 mm er mulig). Substratet som skal mønstret er belagt med et tynt lag av fotoresist (en UV-følsom polymer). Den belagte polymer blir deretter justert og bringes i nær kontakt med masken. En UV-kilde brukes slik at ubeskyttede områder er bestrålt og derfor blir oppløselige og kan fjernes, i det neste utviklingstrinn, og etterlater en parylene-C representasjon av maskemønsteret bak. Denne prosessen oppsto under utvikling av halvlederkomponenter. Som sådan, er silisiumskiver ofte brukt som et substrat. Fotolitografisk deponering av parylene-C på SiO 2 er dermed en enkel og pålitelig prosess som rutinemessig foregår i mikroelektroniske renrom fasiliteter.
Mens parylene harflere ønske bioteknologi egenskaper (kjemisk inert, ikke bio-nedbrytbare), er en faktor som begrenser sin direkte bruk i celle mønster sin medfødt dårlig celle klebrighet, skyldes det delvis sin ekstreme hydrofobitet. Likevel har parylene-C tidligere blitt brukt indirekte for celle mønster, for eksempel som en peel-away cellular mal 12,13. Denne fremgangsmåten er begrenset av dårlig oppløsning og krever flere trinn. Den prosess som er beskrevet her utnytter i stedet en syreetsetrinn, etterfulgt av inkubasjon i serum, for å sikre at parylene-C-regionene blir celle-klebemiddel, gjennom en kombinasjon av reduksjon av hydrofobisitet og serumproteinbinding.
Sluttresultatet er en konstruksjon sammensatt av to forskjellige substrater, som, etter å ha biologisk aktivering, manifesterer respektive cyto-klebende eller cyto-frastøtende egenskaper og så representerer et effektivt celle pattering plattform. Viktigere, er det ikke nødvendig å innføre biologiske agents inn i renrommet anlegget som mønstrede underlag kan lagres på ubestemt tid før bruk (hvorpå de er aktivert ved hjelp av kalvefosterserum eller annen aktiveringsoppløsning).
Dette parylene-C/SiO 세스 mønster plattformen er derfor en god kandidat for en koalisjon med MEMS-komponenter, som fabrikasjon prosesser så tett speile de som brukes for mikroelektroniske fabrikasjon.
Nedsenking av chips i piranha syre tjener ikke bare til å fjerne eventuelle rester av organisk materiale, men også etser de substratoverflater. Dette er nøkkelen til å muliggjør effektiv aktivering med fetal bovine serum. Unnlatelse av å gjøre dette hindrer celle-mønster og dypt endrer celle atferd på brikken. Det er ingen krav til å sterilisere chips etter rengjøring med piraja syre. Faktisk sterilisering etter UV-eksponering har vist seg å svekke celle mønster på en doseavhengig måte 13. Hensyn må tas for å vaske av all gjenværende fotoresist etter fotolitografisk prosessen. Vedvarende fotoresist kan fungere som en uønsket cyto-klebende lag som overstyrer mønster diktert av parylene-C/SiO 세스 geometri. Aceton er effektive ved bruk av den fotolitografiske prosess som er beskrevet ovenfor, og med de angitte reagenser. Imidlertid kan andre typer av fotoresist krever en annen oppløsningsmiddel.
For å vurdere effekten og suksess for f.nt fremstillingstrinn, kan kontaktvinkelen av de to kontrast substrater måles. Figur 2 illustrerer de endringer som inntreffer i løpet av brikken aktiveringsprosessen. Det er sannsynlig, men det bestemte lim og frastøtende proteinkomponenter i serum slutt aktivere parylene-mønstrede chip å utøve sine respektive cyto-lim eller cyto-frastøtende egenskaper.
Alle representative resultatene brukes chips med en parylene tykkelse på 100 nm, selv om vi har lykkes mønstret med både tykkere og tynnere Parylene lag. Viktigere, tillater denne fotolitografisk etsing teknikken mye større tredimensjonal styring av parylene konfigurasjon enn den som er illustrert her. For eksempel, ved bruk av en kombinasjon av fotomasker, er det mulig å lage Parylene regioner av blandet tykkelse. Dette åpner veien for å skape cellekulturer med definert tredimensjonale topografi, går utover bare dikterer regioner av celle adhesjon / repulSion, potensielt tilby et middel til å integrere microfluidic kanaler inn i konstruksjonen.
Som vist, er imidlertid dette mønster plattformen ikke universelt effektive over celletyper. Ulike cellelinjer, med sine varierte celleadhesjonsmolekylet profiler, ikke overrask oppføre seg annerledes når kultivert på denne plattformen. Vi har ennå ikke identifisert de viktigste komponentene i serum, og heller ikke gratis celle-membran reseptorer, som danner grunnlag for denne celle-mønster plattform. Gjør du det i fremtiden lover å utvide sin nytte og spesifisitet. For eksempel kan en "ikke-mønster-cellelinje bli genetisk modifisert for å uttrykke den nødvendige adhesjonsmolekyl, og slik fremme mønster.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Wellcome Trust Klinisk PhD-stipendiat (ECAT).
Layout editor software package | e.g. CleWin 5.0 from WieWeb, http://www.wieweb.com/ns6/index.html | Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture | |
Bespoke photo mask | e.g. Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland, www.compugraphics-photomasks.com | Either fabricate in-house of facilities exist or commision | |
3" Silicon wafers | e.g. Siltronix, Archamps, France, http://www.siltronix.com | ||
Atmospheric horizontal furnace | e.g. Sandvik, http://www.mrlind.com | For oxidising silicon wafer | |
Small spot spectroscopic reflectometer | e.g. Nanometrics NanoSpec 3000 reflectometer, www.nanometrics.com/ | To measure depth of silicon dioxide layer | |
Silane adhesion promoter | e.g. Merck Silane A174 adhesion promoter. Merck Chemicals, www.merck-chemicals.de/ | 1076730050 | Pre-applied to wafer to encourage parylene deposition |
Parylene-C | e.g. Ultra Electronics, www.ultra-cems.com | ||
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010 | SCS equipment, Surrye, UK, www.scscoatings.com/ | Model PDS2010 | |
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter | e.g. SpiChem, www.2spi.com | ||
Automated track system for dispensing photoresist on wafers. | e.g SVG (silicon Valley Group) 3 inch photo-resist track, | Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Pre-bake oven cures the resist. | |
Photo-resist: Rohm & Haas | Rohm & Haas, www.rohmhaas.com/ | SPR350-1.2 positive photo-resist | |
Phot-mask aligner | e.g. Suss Microtech MA/BA8 mask aligner, www.suss.com | ||
Microchem MF-26A developer | Microchem MF-26A developer, www.microchem.com | Removes exposed reogions of photoresist | |
Plasma etch system | e.g. JLS RIE80 etch system, JLS Designs, www.jlsdesigns.co.uk | Removes exposed regions of parylene | |
Wafer dicing saw | e.g. DISCO DAD 680 Dicing Saw, DISCO Corporation, Japan, www.disco.co.jp | ||
Acetone | e.g. Fisher Scientific, www.fishersci.com/ | A929-4 | To wash off residual photoresist |
30% Hydrogen Peroxide | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | H1009 | |
98% Sulphuric Acid | e.g. Sigma-Aldrich, www.sigmaaldrich.com | 435589 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 10437 | Standard chip activation. |
Hank's Balanced Salt Solution | Gibco-Invitrogen, www.invitrogen.com | 14170 |