비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

Summary

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

Abstract

전산 생물학의 시대에, 새로운 높은 처리량 실험 시스템은 그들이 예측 목적의 유효성을 검사 할 수 있도록 모델을 채우고 세분화하기 위해 필요합니다. 이상적으로 그러한 시스템은 타임 코스 데이터가 수득 될 때 샘플링 및 파괴 분석을 배제 저용량, 것이다. 필요한 것은 실시간으로 그리고 간접적으로 필요한 정보를보고 할 수있는 시츄 모니터링 도구이다. 흥미로운 옵션은 형광등을 사용하는 것입니다, 단백질 기반의 세포 내 농도의 기자로 생체 내 생물학적 센서에. 대사 산물의 정량에 응용 프로그램을 발견했습니다 생체 바이오 센서의 하나의 특정 클래스는 리간드 결합 도메인에 의해 연결된 두 개의 형광 단백질 사이의 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기반으로합니다. 통합 생물 센서 (FIBS를) FRET이 구조적으로 세포주 내에서 생산, 그들은 빠른 응답 시간과 자신의 스펙트럼 차이세포 내 대사 산물의 농도에 따라 변경 racteristics. 본 논문에서는 세포 내 대사 산물 농도의 미래 정량을 가능하게하기 위해 구조적으로 포도당과 글루타민 FIBS를 표현 (CHO) 세포주 중국어 햄스터 난소를 구성하고 배치 세포 배양 생체 내에서 FIBS를 교정하는 방법이 설명되어 있습니다. 유가 식 CHO 세포 배양에서의 데이터 FIBS가 세포 내 농도의 결과 변화를 검출하는 각각의 경우에 수 있었다고 보여준다. 독립적 효소 분석에 의해 확인 된 FIBS 및 이전 구성 검량선으로부터 형광 신호를 이용하여, 세포 내 농도를 정확하게 측정 하였다.

Introduction

대사 산물의 모니터링은 공정 개발, 미디어 및 공급 설계 및 대사 공학을 포함한 바이오의 다양한 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 다양한 방법은 효소 ^1, 화학 ^{2, 3} 또는 결합 분석을 사용하여 농도를 측정 가능하다. 흥미로운 옵션은 형광등을 사용하는 것입니다, 단백질 기반의 주요 대사 산물의 세포 내 농도의 기자로 생체 내 생물학적 센서에. 소형화는 실제로 신호 대 잡음비의 ^4,5을 향상시키고 단백질 기반 센서 유전자 제공된 외인성 시약 대사 분석 필요 없다는 의미를 인코딩 할 수있는 매우 낮은 볼륨 내 분석, 형광 편리한 도구이다. 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 바이오 센서는 리간드 결합 도메인에 의해 연결된 두 개의 형광 단백질로 구성되어 있습니다. FRET은 수용체의 형광 분자 locat입니다에 사진 흥분 기증자로부터의 에너지의 비 복사 전송합니다 근접 (<100)에 에드. 리간드 결합 또는 벽개 차례로, 발광 스펙트럼의 변화에​​ 의해 측정 FRET 효율의 변화로 이어지는, 형광체의 근접성의 변화를 유도하고, 센서의 형태 적 변화를 일으키는. FRET 집적 생물학적 센서 (FIBS)는 구성 적 세포주 내에서 생산되고, 그 스펙트럼 특성은 세포 내의 대사 물질의 농도에 따라 변경. FIBS 동적 모델 ^6에 대한 측정을위한 이상적 빠른 응답 시간이있다. 이전 응용 프로그램은 ^7-9 단일 및 다중 ^열 대사를 모니터링하고 시공간 분포 ^(11)에 데이터를 제공하는 것을 포함. 리간드 결합 에너지 전송 및 리간드 결합 가까이 접촉 (그림 1)에 두 개의 형광 물질을 제공 아포 민을 낮추는 형광의 근접을 방해 아포 - 최대 : FIBS는 두 가지 구성으로 만들 수 있습니다.

이 작품에서 _content은 ">, 프로토콜은 구조적으로 신진 대사, 포도당 또는 글루타민 FIBS를 표현 (CHO) 세포주 중국어 햄스터 난소 구축을 위해 제공됩니다. 방법은 생체 내에서 센서의 교정에 설립되어 미래의 정량을 사용하도록 도 2에 제시된 것처럼. 이것을 기초 세포 내 대사 산물 농도의 측정은, 글루코스 또는 글루타민의 세포 내 농도가 어느이 영양분이 공정 중 높은 농도로 첨가하는, 유가 식 CHO 세포 배양에서 결정될 수있다. 결과 그것은 비 침습적, 저가이므로 독립적 효소 분석에 의해 확인 된 FIBS 및 이전 구성 검량선으로부터 형광 신호를 이용하여, 세포 내 농도의 정확한 예측이 가능하다는 것을 보여준다.이 방법은 현재의 분석 기술을 통해 상당한 이점을 제공한다 및 패스트 월 될 수 FIBS의 실시간 신호를주는문화 전반에 걸쳐 itored.

Protocol

1. 세포주 부흥 및 유지

1. 8 mM의 L-글루타민, 10 ㎖ / L 100 배의 산틴 / 티미 딘 보충 (완전 성장 매체)로 보충 9 ML CD-CHO 매체에 CHO 세포를 부활.
2. 5 분 100 XG에 원심 분리기.
3. 신선한 완전 성장 배지 10 ㎖에 세포를 재현 탁.
4. 1 ㎖ 샘플을 제거하고 혈구에 트리 판 블루 염색 배제 방법을 사용하여 광학 현미경으로 가능한 세포 농도를 결정한다.
5. 125 ㎖의 3 × 10 ⁵ 세포 / ml의 파종 밀도 문화를 시작는 플라스크를 흔들어.
6. 120 rpm으로 회전하는 궤도 떨고 플랫폼에서, 37 ° C, 5 % CO _2의 가습 분위기 배양기에서 문화를 유지한다.
7. 2 × ¹⁰⁵ 세포 / ml의 접종 밀도로 완전한 성장 배지에서 계대마다 3-4일.

2. 플라스미드 C와 세포 라인의 형질바이오 센서 유전자를 ontaining

1. 대규모 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 준비한다.
2. (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 이전에 형질에 12 ~ 24 시간 세포가 적극적으로 형질 전환시 분할 보장하기 위해 적절한 조건에서 세포를 유지한다.
3. 트리 판 블루 염색 배제 방법을 사용하여 세포를 카운트 한 후 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도에서 진탕 플라스크 125 ㎖ 중의 세포 배양 물을 20 ㎖의 작동 부피를 준비한다.
4. 사용중인 세포주에 적합한 형질 전환 키트를 사용합니다. 형질 감염 시약 비율 플라스미드 DNA는 세포주 및 벡터에 의존 할 것이다. 그것은이가 전에 최종 형질을 실시하여 제조업체가 지정한 범위 내에서 비​​율의 범위를 테스트하여 최적화하는 것이 좋습니다. 또한 세포하지만 DNA를 포함하는 적어도 하나의 음성 대조군의 문화를 유지한다.
5. 정적 모드에서 4 일 동안 부화 후 SHAKI로 전송125 rpm으로 회전 NG 플랫폼입니다.
6. 킬 (kill) 곡선에 의해 결정되는 적절한 농도로 플라스미드 선택에 대한 적절한 항생제를 추가합니다. 본 연구에서는, 제 오신는 형질 세포의 선택을 위해 400 ㎍ / ㎖의 최종 농도로 첨가 하였다.
7. 제어 잘 세포가 사망 할 때까지, 항생제마다 추가 세포주에 대한 적절한 시간 간격으로 미디어를 변경합니다.
8. 문화를 동요로 진행하는 가장 합류 우물을 사용합니다.
9. 프리즈 믹스 1 ㎖에 10 ⁷ 가능한 세포를 포함하는 극저온 유리 병에서 세포를 동결 세포 은행을 설정합니다. 본 연구에서는이 92​​.5 % 성장 매체와 7.5 %의 디메틸 설폭 사이드로 구성되어 있습니다.

3. 배치 및 유가 세포 성장 곡선

1. 50 ㎖의 작업 볼륨 플라스크를 흔들어 250 ML의 형질 CHO 세포의 세중의 세포 배양을 설정하기 위해 위 세포의 유지 보수에 대한 지침을 따르십시오.
2. cultu 유지가습 셀 125 rpm으로 회전하는 궤도 떨고 플랫폼에 5 % CO _2와 37 ° C에서 인큐베이터,,, 24 시간 간격으로 각 성장 문화에서 4.1 ㎖의 시료를 제거있는 입술.
3. 트리 판 블루 염색 배제 방법으로 생존 세포의 농도와 세포 생존 능력을 확인하기 위해 샘플 100 μl를 사용합니다.
4. 가능한 세포 농도가 0으로 감소 될 때까지 반복합니다.
5. 유가 세포 배양이 각각 36 ㎜, 4 mm의 초기 값으로 자신의 농도를 복원하기 위해 6 일에 포도당 또는 글루타민의 적절한 양의 보충을위한 반복합니다. 그것은 순수의 동일 부피 (여기서는 12 ml)로 공급되어야하는 부가 제어 문화도 유지되어 추천.

4. 비율 측정을 FRET

1. 4 ℃에서 5 분 100 XG에서 위의 단계 3.2 원심 분리기에서 분리 매일 시료 2 ㎖를 타고
2. Resusp얼음 냉각 된 인산염 완충 식염수 (PBS)으로 2 ml의 세포 펠렛을 끝냈다. 6 잘 플레이트에이를 전송하고 잘 하나에 대한 세포를 포함하지 않는 빈 샘플을 추가합니다.
3. 즉시 435분의 465 NM (파란색)과 510분의 520 nm의 (노란색)의 435분의 430 nm의 방출 파장의 여기 파장에 파란색과 노란색 형광의 수준을 측정한다.
4. FRET 비율 (검출 파란색 형광 검출에 노란색 형광의 비율)을 계산합니다.

5. 대사 산물 분석 실험

1. 4 ℃에서 5 분 100 XG에서 위의 단계 3.2 원심 분리기에서 분리 매일 시료 2 ㎖를 타고 뜨는을 제거합니다.
2. 5 분 100 XG에 다시 3 ㎖의 얼음 차가운 PBS와 원심 분리기에 세포 펠렛을 Resuspend.
3. 뜨는을 제거하고 위 3 ㎖ 얼음 차가운 PBS에 세포 펠렛을 resuspend. 15 초 펄스에서 3 분마다 15 초 오프 샘플 배를 초음파 처리. 이때, 셀 여분원하는 경우 CTS는 고정 할 수 있습니다.
4. (자료 표 참조) 세포 내 포도당 농도를 결정하기 위해 세포 추출물의 샘플에 대한 제조 업체의 지침에 따라 적절한 혈당 분석 키트를 사용합니다.
   참고 : 표준 곡선을 구성하는 적절한 기준을 사용합니다. 본 연구에서는 표준의 농도는 0 ~ 100 밀리미터 사이였다.
5. 표준에 대한 측정 값을 사용하여 표준 곡선을 생성하고 (이 경우 : Y = 1310.51x - y는 흡광도 읽기와 x는 포도당 농도입니다 723.43) 최적의 선형 방정식을 찾을 수 있습니다.
6. 표준 곡선을 사용하여 계정에 희석 복용 포도당 농도를 계산한다. 세포 내 포도당 농도는이 식을 이용하여 계산 될 수있다 :
   
   CHO 세포의 경우, 단일 셀 볼륨은 12 μM ^(12)의 기포 지름을 이용하여 산출했다
7. (자료 표 참조) 세포 내 글루타민 농도를 결정하기 위해 세포 추출물의 샘플에 대한 제조 업체의 지침에 따라 적절한 글루타민 분석 키트를 사용합니다.
   참고 : 표준 곡선을 구성하는 적절한 기준을 사용합니다. 본 연구에서는 표준의 농도는 0-2 사이 밀리미터였다.
8. 상기 5.5에서와 같이, (Y는 흡광도 판독 및 x는 Y = + 17.1 203.1x는 글루코스 농도가이 경우에) 검정 곡선을 작도
9. 표준 곡선을 사용하여 계정에 희석을 고려하여 샘플의 글루타민 농도를 계산한다. 세포 내 글루타민 농도는 상기 수학 식 1을 사용하여 계산 될 수있다.

Results

방법론의 개요는 그림 2에 표시됩니다. 여기에 제시 한 연구에서, CHO 세포 FIBS 벡터와 안정 세포주에 형질 전환 된 400 ㎍ / ㎖의 오신의 항생제 압력에 선정되었다. 구조적으로 포도당과 글루타민 센서를 발현 개의 분리 안정한 세포주 따라서 생성되었다.도 1은 본 연구에서 사용 된 두 개의 바이오 센서의 구성을 도시한다. 글루코스 센서는 아포 - 맥스 원리에 근거하고 대응하는 플라스미드를 pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite이다. 이것은 향상된 시안 형광 단백질 (ECFP)로 이루어지는 군으로부터의 융합 및 E. F16A의 돌연변이에 향상된 옐로우 형광 단백질 (EYFP)의 아프로디테 변종 대장균 포도당 / 갈락토오스가 결합 단백질을 세포질. 11 개의 아미노산 잔기는 FRET ^효율성을 향상시키기 위해 ¹³ 링커 영역으로부터 제거 하였다. 이 벡터를 이용하여 uniq를 p...

Discussion

FIBS는 방법을 담금질 추출에서 발생하는 불확실성을 제거,이 경우 성장을 제한 영양소로, 생체 내 및 주요 분자의 현장 정량에 수 있습니다. 결과는 FIBS 신호 및 글루타민 및 글루코스 0.3-2 mm를 위해 1-5 mm 인 세포 내 농도 간의 상관 관계가 있다는 것을 시사한다. 배치 CHO 세포 배양,이 농도는, 지수 정지, 초기 하락 단계에서 발생된다. 지수 및 정지상은 적절한 공급 전략 디자인의 관점에서 가장 중요하다; 세포의 대사 요구를 추정하기위한 이러한 바이오 센서의 사용에 따라서, 공업 적으로 적합하다. 유가 식 실험 결과 세포 내 글루코스 및 글루타민 농도의 추정들을 제공하기 FIBS '적합성을 확인한다. 이전 시점에서 전시 편차가 있기 때문에 낮은 생존 세포 숫자 일어났던 수 있습니다BER들 및 / 또는 인해 글루코스 FIBS의 경우에서 예를 들면 다른 갈락토스 대사, 순서 및 글루타민 FIBS의 경우는 다른 아미노산에 의한 간섭. 구체적으로는 FRET...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	; 연구의 목표에 따라 달라질 것입니다
.	Life Tecnologies
TransIT-PRO 형질주입 시약	Mirus Bio	MIR 5700	형질주입은 연구 대상 세포주에 적합한 모든 방법을 사용하여 수행할 수 있습니다.
Zeocin	Invivogen
CD-CHO 매체	Life Technologies	10743-011	세포 성장 배지는 연구 대상 세포에 따라 다릅니다
100x HT Supplement	Life Technologies	11067-030
L-글루타민 200mM(100x), Liquid	Life Technologies	25030032
InfinitePRO 200 플레이트 리더	Tecan	FLx800TBI	필요한 파장에 액세스할 수 있는 모든 96웰 형광 플레이트 리더로 대체 가능
플레이트 리더용 필터	Tecan	30000463
Maxiprep 플라스미드 정제 키트	Qiagen	12163	어떤 적합한 키트든 대체할 수 있습니다
Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit	Invitrogen	A22189	어떤 적합한 키트라도 대체될 수 있습니다
EnzyChrom  글루타민 분석 키트	바이오 분석 시스템	EOAC-100	어떤 적절한 키트든 대체할 수 있습니다.
개선된 Neubauer 혈구측정기	Fisher Scientific	MNK-420-010N
인큐베이터	누에르	NU-5510E