방법 논문

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

DOI:

10.3791/51544

⸱

2014년 8월 6일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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비례 생체 분자 비콘 (RBMBs)는 살아있는 세포에서 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체로 사용할 수 있습니다. 여기서 우리는 RBMBs, microporation 실시간으로 단일 RNA 전 사체의 형광 이미징에 의해 세포로 RBMBs 전달의 준비 및 정제에 대해 설명합니다.

초록

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두 유전자 발현의 시공간적 규제 세포 기능에 중요한 영향을 미칠 수 성장 실현 단일 살아있는 세포에서 개별 RNA 전 사체를 시각화하기 위해 다양한 기술이 개발되었다. 최근에 설명 된 한가지 유망한 기술은 3'-비 번역 영역 RBMB 표적 서열의 적어도 네 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었다 RNA 전 사체를 검출 올리고 뉴클레오타이드 기반의 광학 탐침, 비율 적 이분자 비컨 (RBMB)를 이용한다. RBMBs 구체적으로 보완 RNA에 혼성화에 따라 밝은 형광 신호를 방출하도록 설계되어 있지만, 그렇지 않으면 침묵 상태로 유지됩니다. 이 방법에서는 프로브의 합성 사용 적색 편이, 광 안정성 허용하고, 높은 발광 유기 염료는 촬상을 위해 사용된다. 넓은 필드 형광 현미경으로 볼 때 개별 형광 명소의 설계 RNA 전 사체 결과에 여러 RBMBs의 결합. 결과적으로, 각각의 RNA 전 사체의 이동이 용이 형광 화상의 시계열을 촬영하여 실시간으로 시각화 될 수있다. 여기에서 우리는 microporation에 의해 세포로 제조 및 정제 RBMBs의 배달을 설명하고 살고 셀 단일 RNA 전 사체의 이미지를.

서론

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RNA 전 사체의 발현 및 조절은 세포의 행동과 운명을 제어하기위한 주로 담당하는 복잡하고 역동적 인 과정이다. 지시 된 세포 기능의 RNA의 중요성이 얼마 동안 알려져 있지만,이 가장 RNA 분석 도구는 전사 붕괴 중요 규제 이벤트를 캡처하기 위해 필요한 공간 및 시간 해상도가 부족하기 때문에, RNA 들간의 연결을 그리는 힘들다 인신 매매 및 지역화 된 RNA 처리. 이것은 각각의 RNA 전 사체가 실시간 1에 살아있는 세포에 시각화 할 수 있도록 여러 기술의 출현하게되었다. 아마,이 기술의 가장 눈에 띄는는 3'-UTR 2,3에 MS2 결합 부위의 탠덤 반복을 포함하도록 설계되었습니다 RNA를 대상으로 GFP-MS2 융합 단백질을 이용한다. 가까운 거리에 여러 GFP 분자를 제공함으로써, 각각의 RNA 전 사체는 밝은 형광 점으로 나타나는형광 현미경을 통한. GFP-MS2 시스템은 직접 시각화 및 전사의 측정 4,5 분출 독특한 서브 셀룰러 지역화 및 처리 6-9의 검출, 및 RNA 수송층 (10)의 실시간 영상을 포함한 RNA 동작으로 전례 통찰력을 제공하고있다. 그러나, GFP-MS2 시스템의 엄청난 잠재력에도 불구하고, 언 바운드 GFP-MS2 융합 단백질이 기술의 다양성과 ....

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프로토콜

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이 프로토콜에서는 하나의 올리고 뉴클레오티드 (RBMB1)는 CF640R 기자 염료와의 5'-끝 부분에 표시하고, 순서를 가지고 : 5' mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC 뮤 mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC mUmU-3 '. 머리 핀의 자형 구조의 형성을 구동 자체 보완 도메인은 굵게 표시되어 있습니다. 둘째 올리고 뉴클레오티드 (RBMB2)는 아이오와 블랙 RQ-SP 거제와 '말단에 표지와 순서가되었다 : 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'.

RBMBs의 1 준비

  1. RBMB1 및 RBMB2 올리고 뉴클레오티드를 포함하는 튜브의 빠른 스핀을 수행 건조 올리고 뉴클레오티드는 100 μM의 최종 농도의 DNase와의 RNase가없는 물에 튜브의 바닥 및 재현 탁입니다 보장합니다. 예를 들어, 올리고 뉴클레오티드의 10 nmol을 샘플을 물 100 ㎕에 재현 탁한다.
  2. MEAS우레 UV-VIS 분광에 의해 RBMB1 및 RBMB2 재고 샘플의 정....

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결과

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넓은 필드 형광 현미경 (도 2)에 의해 촬상 할 때 곧 RBMBs의 존재 HT1080 세포 microporation 따라, 조작 된 개별 RNA 전 사체들이 3'-UTR에서 여러 RBMB 결합 부위를 포함 할뿐만 밝은 형광 점으로 나타나는. 적은 네 RBMB 결합 부위 개별 RNA 전 사체는 라이브 세포 이미징 될 수 있지만, 3'-UTR에 결합 부위보다 RBMB, 강한 형광 신호. 신호 인해 photobleaching에 손실되기 전에 또한, 이상 각 증명서에 바인딩 더 RBMBs는 RNA가 가시화 될 수있다. 이 프로토콜에서, RNA는 3'-UTR에서 RBMB 표적 서열의 96 탠덤 반복을 포함 할 수 있도록 설계되었다. 스트리밍 영상의 획득은 개별 RNA 전 사체를 실시간 (동영상 1)에서 이미지를 만들 수 있습니다. 개인 RNA 전 사체는 쉽게 세포질과 핵 O 내에서 이동 볼 수 있습니다세포 바. 관광 명소의 대부분은 드문 경우에, 브라운 또는 하위 확산 움직.......

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토론

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기존의 넓은 필드 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 이미지를 하나의 설계 RNA 전 사체 할 수있는 능력은 각 RNA 전 사체 언 바운드 형광 프로브로부터 나오는 낮은 형광 배경에 관련 지을 수있는 밝고 광 안정성 형광 신호를 필요로한다. 이 방법에서, 밝은 형광 신호는 각각의 RNA 전 사체 상에, (96까지) 다중 올리고 뉴클레오티드 계 형광 프로브, 즉 RBMBs 혼성화함으로써 달성된다. 그러나, 몇 네 바인딩 사이트는 16 충분하다. 집합 신호는 실시간으로 추적 할 수있는 밝은 스폿 형광 초래한다. 집단 신호가 손실되기 전에 형광 염료의 실질적인 분획 photobleached되어야하므로 여러 프로브의 존재는 또한, 이상 촬상 시간을 허용한다. 그것은이 기술은 RNA 생물학에 독특한 통찰을 제공 번째 측정에서 레인 징 동작 RNA의 광범위한 연구를 위해 허용되는 것으로 구상표적 RNA의 고유 한 세포 내 현지화 패턴을 관찰하는 다양한 외부 자극, RNA의 운명과 수명을 공부하고, RNA.......

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공개 사항

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닥터 마크 Behlke 박사 링 황는 원고에 기술 된 화합물의 일부 유사한 판매 올리고 뉴클레오티드를 제공하는 IDT에 의해 사용된다. IDT는 그러나, 상장 회사, 그리고 그들은 개인적으로 IDT의 / 자기 지분을 보유하고 있지 않습니다.

감사의 글

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이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 경력 수상 (0953583) 및 건강 NCI / R21-CA116102의 국립 연구소, NCI / R21-CA125088, NIBIB / R01-EB012065, NCI / R01-CA157766에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
뉴클레아제가 없는 물Life TechnologiesAM9932DEPC 처리 없음
DPBSLife Technologies14190-144No Ca2+ 및 Mg2+
Cary 100 UV-Vis 분광 광도계Agilent Technologies
인산칼륨 이염기성Fisher ScientificP290-500
인산칼륨 일염기Fisher ScientificP284-500
인산나트륨 일염기Fisher ScientificS381-500
마이크로 원심분리기 튜브Eppendorf223641111.5 ml
크로마토그래피 컬럼Kimble Chase Life Science420400-07200.7 x 20 cm
Superdex 75 준비 등급GE 헬스케어17-1044-01
주사기 펌프Braintree ScientificBS-300
주사기BD30103560 ml, Luer-lok 팁
원심 필터 장치, MilliporeUFC501096MW 10,000 차단
원심분리기 5418Eppendorf
Poly-D-lysineSigma-AldrichP7280-5MG동결건조 분말, g-방사선 조사
8웰 챔버 커버 글라스Fisher Scientific155409작업량 0.2-0.5 ml
HT1080ATCCCCL-121인간 섬유육종 세포주
세포 배양 플라스크Corning43063925 cm2
DMEMLife Technologies11965084
페놀 레드 없는Life Technologies21063029고혈당
태아 소 혈청Sigma-AldrichF2442-500ML
페네실린/스트렙토마이신생명 기술15140122
트립신생명 기술253000540.05% 트립신-EDTA
네온 형질주입 시스템생명 기술MPK5000
질주입 시스템 키트생명 기술MPK1096
HemacytometerFisher Scientific02-671-10
Hoescht 33342Life TechnologiesH1399
IX-81 도립 형광 현미경Olympus
SOLA 광 엔진Lumencor
Metamorph분자 장치소프트웨어 제어 현미경
Immersol 오일 518F피셔 사이언티픽12-624-66B
성 성 , , 고포도당 DMEM 네온 형

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-....

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