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방법 논문

가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐​​트 표면에서 혈관 유전자 전송

9.4K 조회수

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DOI:

10.3791/51653

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2014년 8월 12일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

이 논문에서

요약

이 연구는 스텐트의 코팅이 없는 금속 표면에 아데노바이러스 유전자 벡터의 가역적 부착을 보고하고 메쉬 디스크를 모델링합니다. 벡터 고정화에 사용되는 cross-linker의 가수분해에 따라 transduction-competent 바이러스 입자가 지속적으로 방출되면 혈관 세포와 스텐트 동맥에서 내구성 있는 부위 특이적 transgene 발현이 발생합니다.

초록

스텐트 재 협착 널리 관상 동맥 및 말초 동맥의 매우 좁은 부분을 통해 다시 설정 혈액의 흐름에 사용되는 스텐트 기반 재 시술 절차의 주요 합병증을 선물한다. 대안 전략을 제시 할 수있다 방지 재 협착 활성 유전자의 조정 릴리스 할 수있는 혈관 내 스텐트는 현재 약물 방출 스텐트를 사용합니다. 일반적으로 벡터의 물리적 포획을 위해 사용되는 폴리머 코팅과 관련된 과도한 염증 반응을 피하면서 임상 변환을 달성하기 위하여, 유전자 스텐트는 스텐트 고정화 유전자 벡터 방출 및 혈관의 부위 - 특이 적 전달의 예측 동력학을 나타낸다한다. 이 논문은 비스포스포네이트 (PABT)이 가수 분해 가교제 (HC)를 통해 스테인리스 표면을 개질 된 폴리 알릴 아민하는 아데노 바이러스 입자의 가역적 인 결합을 기반으로 스텐트에 아데노 바이러스 유전자 벡터의 무 코팅 테 더링에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 의 가족5 내지 오십일 레인 징의 쇄상 에스테르 가수 분해의 평균 t와 2 관능 성 (아민 - 및 티올 - 반응성) HC는 스텐트 벡터를 연결하기 위해 사용되었다. 벡터 고정화 절차는 일반적으로 9 시간 이내에 수행하고 여러 단계로 구성된다 : PABT (4 시간)의 수용액에 금속 샘플 1) 배양; 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (20 분 간격)으로 설치 PABT 티올 기, 2) 탈; 피리 딜 디티 (PDT) 그룹 (2 시간)과 폴리에틸렌 이민 유도체와 샘플을 반응시켜 금속 표면의 반응성 티올 용량 3) 확장; 디티 오 트레이 톨 (10 분)에 PDT와 티올 기의 4) 변환; HC (1 시간)와 아데노 바이러스의 5) 수정; 크기 배제 칼럼 크로마토 그래피 (15 분) 및 티올 철강 표면 (1 시간)에 티올 반응성 아데노 바이러스 입자의 7)에 의해 수정 고정화 아데노 바이러스 입자의 6)의 정제. 이 기술은 스텐트를 넘어 폭 넓은 잠재적 인 응용 성을 가지고주입 된 이물질 인터페이싱 세포 기질 - 매개 유전자 전달을 통해 자신의 생체 적합성을 향상시키기 위해 판막 장치의 표면 공학을 촉진시켜.

서론

치료 적 양상과 같은 유전자 치료의 효과는 유전자 치료 벡터의 1,2 나쁨 타겟팅 용량에 의해 방해된다. 목표 위치에 유전자 발현의 하위 치료 수준에서 적절한 타겟팅 결과 부족하고, 벡터 및 부호화 치료 제품 4 모두에 대하여 면역 반응을 마운팅 할 책임을 포함한 비 - 표적 기관 03 행 벡터의 넓은 보급에 이르게 5. 하나의 가능성은 전달의 성행위를 상쇄하고 타겟팅 혈액과 림프를 통해 자신의 무료 보급을 배제 형태로 원하는 위치에 유전자 벡터를 소개하는 홍보하는 것을 의미한다. 전형적으로, 이러한 노력들은 물리적 번째 포획하여 주사 부위에서 일시적으로 유지하는 유전자 벡터 수있는 피브린, 콜라겐이나 히알루 론산 하이드로 젤 매트릭스 6-10과 혼합 바이러스 성 또는 비 바이러스 벡터 중 구성된 국소 주사 전달 시스템에 의존고분자 네트워크의 그들.

지역화 된 유전자 치료를위한 또 다른 일반적으로 인정 패러다임 주입 보철 장치 (11, 12)의 표면에 유전자 벡터의 고정화를 이용한다. 영구 이식 의료 (혈관, 기관지, 비뇨기과 및 위장 스텐트, 심장 박동기, 인공 관절, 수술 및 부인과 메시, 등.) 환자 13 수천만에서 연간 사용됩니다. 일반적으로 효과가 있지만,이 장치는 부적절 현재의 의료 관행 14-17에 의해 제어되는 합병증하는 경향이 있습니다. 이식 보철 장치는 현지화 된 유전자 치료 치료를위한 프록시 플랫폼 역할을 할 수있는 특별한 기회를 제공하고 있습니다. 약동학 관점 파묻혀의 동력학을 임플란트 / 조직 인터페이스 유전자 벡터의 높은 지방 농도 모두를 달성하고 둔화 유전자 벡터 결과 비교적 낮은 입력 용량 의료 임플란트 표면에서 유도화이 위치에서 R 제거. 대상 세포 인구에 의해 연장 된 거주지의 결과 및 향상된 흡수으로, 벡터 고정화는 유전자 벡터의 확산을 최소화 할 수 있습니다. 따라서, 비 표적 조직의 부주의 접종이 감소된다.

(또한 기판 매개 유전자 전달 또는 고상 유전자 전달 되나) 이식 생체 재료에 유전자 벡터의 표면 테 더링 사용 세포 배양 및 동물 실험에서 구현되었습니다 모두 특정 (항원 - 항체 18-20, 아비딘 - 비오틴 21, 22) 그리고 23 ~ 26 (요금, 반 데르 발스) 상호 작용 비특이적. 표면이 지나치게 강한 결합이 표적 세포로 내재화 벡터 배제 이후 주입 장치의 표면에 벡터의 공유 결합은 이전에 비 기능적으로 간주되어왔다. 최근이 제한 TET로서 사용 자발적 가수 분해성 가교제의 사용을 통해 극복 될 수 있다는 것을 입증했다아데노 바이러스 벡터의 27,28 스텐트 및 캡시드 단백질의 변성 금속 표면 사이 그녀. 또한, 벡터 방출률 및 생체 외 및 생체 내에서 유전자 발현의 시간 경과 (28)의 가수 분해 반응 속도를 나타내는 다른 가수 분해성 가교제를 이용하여 변조 될 수있다.

본 논문은 활성화 된 금속 표면에 아데노 바이러스 벡터의 가역적 공유 결합에 대한 상세한 프로토콜을 제공하고 스텐트 혈관 성형술의 쥐 경동맥 모델에서 배양 평활근 및 내피 세포 및 생체 내에서 시험 관내에서 이어지는 전달 사건을 연구하는데 유용한 실험 구성 소개 .

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프로토콜

릴리스 실험에 대한 Cy3가 표지 된 아데노 바이러스의 1 준비

  1. (; 산도 9.3 CBB) 탄산염 / 중탄산염 버퍼 650 ㎕의 빈 광고의 2 × 10 12 입자 (약 2 × 10 11 감염성 단위)를 일시 중단합니다.
  2. 0.2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 (2 인 Cy3 (NHS)) 1 ml의 CBB의 아민 반응성 형광 염료의 1 바이알 (0.2 mg)의 내용을 녹인다.
  3. 5 초 동안 바이러스 서스펜션, 소용돌이에 염료 용액 100 μl를 추가하고 (100 ~ 200 RPM)을 흔들어으로 28 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
  4. PBS와 20 ㎖의 파로스 6B 열 평형. Cy3가 표지 광고 서스펜션 드롭 현명한 겔 침대의 중심의 750 μl를 추가합니다.
  5. 바이러스 현탁액은 수지를 투과 한 후, PBS 5 ㎖를 추가한다. 용출액을 폐기하십시오.
  6. PBS의 0.5 ML을 추가하고 레이블이 유리 용기에 용출액을 수집합니다. 열 0.5 ml의 분수의 총 수집이 단계의 10 배를 반복합니다.
  7. 분석 일전자는 바이러스 성 DNA 콘텐츠에 대한 분광 광도계 (260 및 280 nm의)에 의해 분수를 수집.
  8. 260 nm에서 전체 (F1 내지 F10의 합) 광학 밀도 (OD)의 10 % 이상을 함유하는 분획을 풀. 참고 : 일반적으로 분수 F3, F4, F5 및 F6가 풀링과 혼합된다.
  9. 다시 분석 바이러스 성 DNA 함량 및 Cy3에 대한 형광 측정 (550 예 / 570 전각 nm의)에 의해 분광 광도계 (260 및 280 nm의) 및 분석에 의한 혼합 풀링 분수는 각각 캡시드 단백질을 표시. 주 : Cy3가 (NHS)이 검량선 10 -10 -9 -13 몰 / L의 범위가 준비 fluorimetrically 풀링 분획과 동일한 판 상에 정량된다 덮는.
  10. 표지 바이러스 수율 및 라벨 밀도를 계산합니다. 1.19 × 10 12 바이러스 입자 / ㎖를 1cm 경로 길이 29 1 OD 유닛에 대응하는 것으로 가정. 수익률 = [(OD의 260 나노 미터 /1.19)*10 12 * V / 입력 광고 금액] * 100, 외경 260 나노 미터 광학 드는, 상기 공식을 사용하여260 nm에서의 풀링 제형 nsity 및 V 애드 회수율 (%)을 계산하는 풀링 된 제형 (ML)의 체적이다. 수식을 사용하여 라벨 밀도 = C * 6.02 * 10 23 / ​​(OD C가 풀링 된 제제를 Cy3 농도 (몰 / ㎖) 및 외경 260 나노 미터 인 260 나노 미터 /1.19)*10 (12), 풀링 제제의 광학 밀도입니다 260 nm의 평균 인 Cy3 라벨 밀도를 산출한다. 주 : 분류 바이러스의 회수는 통상적 인 입력 도즈의> 70 %이다. 라벨링 밀도는 단일 바이러스 입자 당 600-800 형광 분자이다.
  11. 나누어 각각의 분리 실험에 적합한 작은 부분 (일반적으로 5 × 10 11 입자)에 빈 광고를 Cy3가 표지. NOTE : 현재 프로토콜은 전적으로 분리 실험 Cy3가 표지 된 광고의 사용을 지정한다. 모든 전달 연구가 표지되지 않은 경로로 수행된다.

금속 샘플의 2 활성화

  1. 스테인리스의 워시TEEL은 이소프로판올에 연속적으로 디스크 또는 스테인레스 스틸 스텐트 메쉬 (5 분 × 2) 클로로포름 흔들림 (100 RPM)와 55 ° C에서 (5 분 × 2). 용매를 제거합니다.
  2. 200 ° C에서 30 분 동안 샘플을 가열.
  3. 물에 설치 잠재 티올 그룹 (PABT 27,28,30)와 폴리 알릴 아민의 비스포스포네이트 (100 회전)을 흔들면서 72 °에서 C (/ V w 1 ~ 2 %)을 녹인다. KHCO 3 4.5-5에 산도를 조정.
  4. (100 ~ 200 RPM)을 진탕 72 ° C에서 2-4 시간 동안 PABT 용액에 금속 샘플을 품어. 참고 :이 절차는이 시점에서 일시 정지 할 수있다. 샘플은 4 ℃에서 3 일간 안정하다.
  5. 증류수 (DDW)와 세 번 샘플을 씻어.
  6. 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스에 샘플을 노출 (TCEP 0.1 M 아세트산 버퍼에 15 ㎎ / ㎖)을 28 ° C에서 15 분 동안 (100 ~ 200 RPM)을 진탕.
  7. 탈기 DDW에 5 배를 씻어.
  8. (설치 피리 딜 디티 그룹과 PEI를 2 % 폴리에틸렌 이민에 샘플을 노출 동요 (100 ~ 200 rpm으로 28 ° C에서 2 시간 동안 아르곤 분위기에서 탈기 DDW에서 PDT 27,28,30)). 참고 :이 절차는이 시점에서 일시 정지 할 수있다. 샘플은 4 ° C에서 이주에 대한 안정적이다.
  9. DDW로 샘플을 세 번 씻어.
  10. 티올로 피리 딜 디티 그룹을 변환 할 10 ㎎ / ㎖ 디티 오 트레이 톨 / DDW에 샘플을 노출.
  11. 탈기 DDW 다시 배를 씻어.

3 아데노 바이러스 활성화 및 금속 표면 고정화

  1. (; 산도 9.3 CBB) 탄산염 / 중탄산염 버퍼의 487.5-495 μL에 광고 eGFP는 또는 광고 루크 하나의 5 × 10 11 입자 (약 5 × 10 10 감염성 단위)를 일시 중단합니다. 참고 : Cy3에이 광고 빈 입자를 표지의 분리 연구를 들어, 5 × 10 11을 사용 (CBB와 487.5-495 μL에 볼륨을 조정).
  2. 중간 정도로, (t 2 = 5 D) 빠르게 (가수 분해 속도 28 [변화와 HC를 용해 (t 1 /2 = 12 D) 천천히 (t 2 = 50 D) HC, 즉 RHC, IHC 또는 SHC, 그림 1] 또는 비 분해성 가교제 (NHC), 20 mM의에서 CBB의 설포-LC-SPDP.
  3. 즉시 500 μL (가교제의 200 ~ 500 μM 최종 농도), 소용돌이의 전체 볼륨에 대한 바이러스 서스펜션에 가교제 솔루션의 5-12.5 μl를 추가하고 (진탕 28 ° C에서 1 시간 동안 100 - 배양 200 RPM).
  4. 탈기 5 mM의 EDTA / PBS (EPBS)와 20 ㎖의 파로스 6B 열 평형. 수지 베드의 중심 가교제 변성 광고 현탁액 500 μl를 적하 추가.
  5. 탈기 EPBS의 5 ML을 추가합니다. 용출액을 폐기하십시오.
  6. 탈기 EPBS의 0.5 ML을 추가하고 레이블이 유리 용기에 용출액을 수집합니다. 이 단계 십 0.5 ml의 분수의 총 수집 10 회 반복한다.
  7. 260 및 280 nm에서 분광 광도계를 사용하여 수집 된 분수의 외경을 결정하고 바이러스 역가 (1.19 × 10 12 / ㎖ 이리와! 빨리에 OD 변환한 OD) 29 sponds.
  8. 용출 된 바이러스의> 10 %를 함유하는 분획을 풀 (주 : 일반적으로, 분획 F3-F6). 풀 서스펜션에 대한 분광 역가 분석을 반복합니다.
  9. (2.11 당) 활성 금속의 샘플 바이알에 바이러스 현탁액을 전송합니다. (100 ~ 200 RPM)을 진탕 28 ° C에서 1 시간 동안 아르곤 분위기에서 품어. 주 :이 단계에서 얻어진 광고 닿는 금속 샘플은 상기 프로토콜 섹션 5-7에서 설명한 후속 릴리스 및 전달 실험에 사용된다.

PCR에 의한 표면 관련된 광고 벡터의 4 정량화

  1. NHC, SHC, IHC 및 RHC (N = 각 유형 3) 2 항과 3 항에서 설명한대로를 통해 닿는 표면 고정화 광고 eGFP는 배합 메쉬를 준비합니다.
  2. 바이러스 성 DNA를 분리 QIAamp DNA 마이크로 키트를 사용합니다. ATL (b)의 180 μL로 구성된 혼합물의 200 μl를 포함하는 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 개별적으로 메시를 놓습니다uffer 및 단백질 분해 효소 K의 20 μL (두 키트에서). 같은 혼합물을 함유하는 별도의 튜브로 (검량선 용 표준으로서) 광고 eGFP는 입자의 양을 공지 된 추가. 밤새 떨지 않고 56 ° C에서 품어.
  3. (키트) AL 버퍼의 200 μl를 추가, 소용돌이로 교반하여 혼합 100 % 에탄올 200 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 배양한다.
  4. 1 분 동안 8,000 rpm에서 개인 MinElite의 (키트) 열 스핀에 각 튜브의 혼합물을 전송합니다. 신선한 ALT 버퍼 180 μL와 메쉬 함유 튜브를 씻어 1 분 동안 8,000 rpm으로 각각의 컬럼과 스핀에 추가합니다. 용출액을 폐기하십시오.
  5. 1 분 동안 8,000 rpm에서 AW1의 열로 (키트) 버퍼와 스핀의 500 μl를 추가합니다. 용출액을 폐기하십시오.
  6. 1 분 동안 8,000 rpm에서 AW2의 열로 (키트) 버퍼와 스핀의 500 μl를 추가합니다.
  7. 용출액을 폐기하십시오.
  8. unti 추가 3 분 동안 14,000 rpm으로 회전리터 열이 완전히 건조합니다. 용출액을 폐기하십시오.
  9. 열로을 MilliQ- 등급 물 50 μl를 추가합니다. 5 분 동안 14,000 rpm으로 회전. (키트) 개별 수집 튜브에 각 열에서 용출액의 50 μl를 수집합니다.
  10. 전원 SYBR 녹색 PCR의 다음 (12.5 ㎕의 마스터 믹스, [5'-ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 '], 0.63 μL (10)를 10 μM eGFP는 센스 프라이머의 0.63 μL의 곱셈을 조합하여 PCR 마스터 믹스 솔루션을 준비 μM eGFP는 안티센스 프라이머 [5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 ']을 MilliQ- 등급 물 6.3 μL). "아니오 DNA"컨트롤을 포함하여 계획 반응의 숫자로 이러한 볼륨을 곱하십시오.
  11. 로드 및 마이크로 암페어 광학 96 웰 반응 플레이트의 세중의 우물에 PCR 마스터 믹스의 20 μL (단계 4.8에서) 광고 eGFP는 DNA의 5 μL. 마이크로 암페어 광학 접착 필름과 판을 밀봉합니다. 공기 방울을 제거하기 위해 1 분 동안 1,000 rpm에서 스핀 플레이트.
  12. 7500 리얼 타임 PCR 엔진의 콘센트에 접시를 놓습니다. 7500 시스템 SDS 소프트웨어 (V1.4 이상) 선택의 메인 메뉴에서 "새 실험 만들기"를 참조하십시오. "다음"을 클릭합니다. "새 실험 마법사"화면에서 스크롤 다운 메뉴에서 SYBR 그린을 선택하고 "추가"를 클릭합니다. 판의 레이아웃을 얻기 위해 "다음"을 클릭합니다. SYBR 녹색을 선택, 모든 우물이 분석 될 강조 표시합니다. 연속적으로 더 DNA를 대조군 웰, 광고 eGFP는 DNA의 표준과 미지수를 강조하지 않고, 스크롤 다운 메뉴에서 각각의 명칭을 사용하여 표시한다.
  13. 장비 탭으로 전환합니다. , "해리 단계를 추가"를 선택하여 25 ㎕의 기본적에서 50 μl를 잘 볼륨을 변경합니다. 시작을 클릭합니다.
  14. 아웃 라이어 및 기타 부정 행위에 대한 QC 요약을 확인 후 사용하여 PCR 결과를 분석합니다.

모델 스틸 메쉬에서 가수 분해 크로스 링커 닿는 벡터 입자의 5 출시 속도론

  1. (100 ~ 200 RPM)을 진탕 1 % BSA / PBS (1 시간 × 3)에서 (3.9에 따라) RHC, IHC, SHC 및 NHC를 통해 Cy3가 표지 광고로 유도 메쉬 샘플을 씻으십시오.
  2. 멸균 미세 집게를 사용하여, 용출 완충액 200 μL 채워져 96 - 웰 플레이트의 개별 웰에 메쉬를 배치 (0.1 % BSA / 0.1 % 트윈 -20 / PBS).
  3. 각 메쉬의 중앙 부분의 형광 이미지를 가져 가라. 현미경 및 화상 획득에 사용되는 CCD 카메라의 설정을 기록한다.
  4. 최대 감소 잘 스캔 모드에서 fluorimetrically 판 (550 예 / 570 EM)을 분석. 배경 제어와 같은 비 유도체 메시와 우물을 사용합니다.
  5. (50 회전)을 흔들어으로 37 ° C에서 접시를 품어.
  6. 미리 정해진 시간 (1~30일 범위)에서 메시를 방해하지 않고 용출 버퍼를 대기음 신선한 용출 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 반복 버퍼를 교체 한 후 4.3-4.5 단계를 반복합니다.

배양 Cel에의 6 형질 도입메쉬 고정화 광고 벡터에 의해 LS

  1. 광고 eGFP는 워시 - 또는 광고 루크 (100 RPM)을 진탕 5 분 동안 멸균 PBS로 세 번 메쉬를 -derivatized.
  2. 미세 무균 핀셋을 사용하여 메쉬 디스크를 하나씩 분리하고 개별적 로그 성장 단계에서의 관심의 세포 유형으로 96 - 웰 플레이트의 웰에 넣지.
  3. 5 % CO 2, 37 ℃에서 24 시간 동안 세포를 품어.
  4. 범위와 웰에서 유전자 발현의 공간적 분포를 결정하기 위해 (또는 eGFP는 루시페라아제에 대한 생물 발광 이미징 형광 현미경, 형광 측정) 각각의 비 종단 종점 분석법을 사용한다.
  5. 선택적으로, PBS에 대한 대체 매체는 낮은 eGFP는 표현이 예상되는 경우 형광 측정 분석 (535분의 485 나노 미터)의 감도를 증가시킵니다. 주 : 형광이 잘 스캔 기능이 장착 된 경우에 세포를 웰 eGFP는이 발현의 공간 분포를 평가하기 위해 잘 - 스캔 모드에서 플레이트를 읽었다. 환율 PB형광 측정을 완료 한 후 매체에 대한 S.
  6. 이미지 FITC 필터 세트를 사용 (기본 및 외곽 메쉬 모두) 광고 eGFP는 -eluting 메시와 우물에서 형질 세포. 40-200X 배율 대표 이미지를 가져 가라. 형광 현미경과 이미지의 취득에 사용 된 CCD 카메라의 정확한 설정을 기록합니다.
  7. 직접 광고 루크 -eluting와 우물 PBS에 루시페린 주식의 5 μl를 추가 (10 ㎎ / ㎖)는 이전에 생물 발광 영상에 10 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2에서 배양 / ㎖ 및 500 μg의 최종 농도 메쉬 . 기음 미디어와 영상 후 루시페린이없는 용지로 교체합니다.
  8. 일정 시간 (2 주까지)에서 반복 엔드 포인트 분석 기판 매개 유전자 전달 다음 리포터 유전자 발현의 역학을 연구한다.

지연된 시점에서 보존 전달 용량의 7 검증

  1. 준비 광고 eGFP는 드벡터 테 더링 RHC, IHC, SHC와 NHC를 사용 rivati​​zed 메시 (2.1-2.11 당과 3.1-3.9) 개별적으로 (BAEC을 60-80% 합류 소의 대동맥 내피 세포를 96 웰 플레이트에서 메시를 배치 ).
  2. (6.4-6.5 당) 형광 현미경과 형광 측정을 사용하여 1과 이일 후 메쉬 배치에 메쉬 고정 광고 eGFP는 배양 BAEC의 전달을 분석 할 수 있습니다.
  3. 전달 개시 후 48 시간이 두 번 PBS와 메쉬 함유 우물을 씻는다.
  4. 각 웰에 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl를 추가하고 (100 회전)을 흔들어으로 37 ° C에서 15 분 동안 배양한다. PBS로 세척 배.
  5. 메쉬와 관련된 모든 eGFP는 양성 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해 형광 현미경과 형광 측정을 사용합니다.
  6. 갓 60~80% 초기 시딩 밀도 (2-2.7 × 10 4 세포 / 웰)에서 부분적으로 발표 메쉬와 우물에 BAEC 계대 씨입니다.
  7. 37 ° C, 5 % CO에서 접시를 품어 이 이전 형광 현미경과 형광 측정에 의해 "새로운"전달 이벤트의 평가에 시간이 소정의 기간 (1-10일)합니다.

(8) 광고 용출 스텐트 혈관 성형술의 쥐 경동맥 모델에 스텐트 배포

  1. 이 프로토콜에 설명 된 모든 동물의 절차는 실험 동물 사용에 대한 연방 규정을 준수하고 필라델피아 아동 병원의 IACUC에 의해 승인되었다. 모든 악기는 오토 클레이브 멸균 무균 수술 조건을 준수합니다. 비드 살균기 최대 5 연속 동물 악기의 사용을 사이에 사용된다 연속 불임을 보장합니다.
  2. 광고 루크가 2.1-2.11 및 3.1-3.9에 따라 스텐트를 -eluting 준비합니다. 사용하기 전에 더 이상 24 이상의 시간 동안 4 ° C에서 멸균 PBS에서 바이러스 유도 스텐트를 저장합니다.
  3. IP 케타민 (100 ㎎ / ㎏) 주입, 및 자일 라진 (5 밀리그램 / kg)와 수컷 흰쥐 (400-450그램)를 마취. 드발 핀치 반응과 근육 TONUS에 의해 마취의 깊이를 termine. 각막과 공막의 건조를 방지하기 위해 안과 의사 연고를 적용합니다. 참고 : 4 %와 유도 및 마취 유지를위한 2 % 이소 플루 란 (isoflurane) (/ 분 1 L)와 흡입 마취는 각각 경험이 사용자에 대해 사용하지 않는 것이 좋습니다 것이 가능하지만 동물의 목 지역에 무료로 액세스를 방해합니다.
  4. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 재평가. 면도 및 무균 준비 목과 가슴 위쪽 영역입니다. 항생제 (세파 졸린을 20 ㎎ / ㎏, IM) 관리, 진통 (멜 록시 캄 0.5 ㎎ / ㎏, SC) 및 염수 (10 ㎖ / kg, SC)를. 24 G 카테터와 꼬리 정맥 카테 테르를 꽂다 헤파린 관리 (200 IU / kg을, IV). 주의 : 10 ㎎ / ㎏ (IM) enrofloxacin (Baytril)의 투여 량은 세파 졸린 대신 사용될 수있다. 그람 양성 세균에 중요한 활동이 부족한 항생제를 사용하지 마십시오. / kg carprofen (Rimadyl) 10 ~ 15 mg의 선제 진통제 대신 멜 록시 캄 사용될 수있다. 마약 진통제 (전자.g., 모르핀, ​​부 프레 노르 핀은) 때문에 호흡 - 우울 성질 피해야한다.
  5. 피부와 목의 밴드를 통해 중간 선 절개를 수행합니다. 왼쪽 외부 경동맥을 분리 무딘 절개 기법을 사용합니다. 타이 - 오프 외부 경동맥을 가장 말단 가까이 현장에서. 내 경동맥의 기원에 슬라이딩 임시 합자를 적용합니다.
  6. 왼쪽 외부 경동맥에 2 mm의 arteriotomy의 절개를합니다.
  7. 외부 경동맥의 절개를 통해 경동맥에 2 프랑​​스어 포가티 카테터를 삽입합니다. 식염수 카테터의 팁을 팽창 및 내피 맨땅으로 만들어 버리기도하기 위해 경동맥 분기로 대동맥 궁으로부터 배를 전달한다.
  8. 포가티 카테터 이상 경동맥에 튜브의 조각 (1.04 mm 외경, 0.99 mm ID)를 밀어 넣습니다. 포가티 카테터를 철회.
  9. 마운트 및 광고 루크 압착는 1.5의 풍선을 통해 스텐트를 -derivatizedmm 직경의 혈관 성형술 카테터. 테프론 튜브를 통해 스텐트를 삽입하고 경동맥의 중앙부로 진행합니다. 튜브 또는 용기 벽에 스텐트를 문질러하지 마십시오.
  10. 30 초 동안 12 기압 스텐트를 배포하고 혈관 성형술의 카테터를 철회.
  11. arteriotomy 사이트에 외부 경동맥의 근위부를 오프 묶어 내 경동맥에 임시 합자를 놓습니다.
  12. 피부를 4.0 Vicryl 봉합사를 실행하고 주식과 층의 수술 상처를 복구합니다.
  13. 외래까지 온난화 패드에 동물을 복구 및 격리 된 케이지로 돌아갑니다. 통증이나 불편의 징후는 일반적으로 수술 후 첫 12 시간 이상으로 수술 후 동물에 의해 전시되지 않은 반면, 72 시간 동안 멜 록시 캄의 치료 (0.5 ㎎ / ㎏, 매일 SC)의 확장을 고려하십시오.

동맥 유전자 발현의 9 생물 발광 영상

  1. 일정 시점에서 (일일 - 3경동맥의 유전자 용출 스텐트 배포 후 주 범위), 이소 플루 란 흡입 마취 (산소 2-4 % 이소 플루 란 (isoflurane)을)를 사용하여 쥐를 마취.
  2. , 수술 스테이플을 제거 무균 사이트를 준비하고 수술 상처를 다시 엽니 다. 왼쪽 경동맥에 무딘 박리 재 이득 액세스를 사용하고, 미주 신경과 인접한 결합 조직에서 분리.
  3. PBS의 PBS 25 % 플루로 닉 F-127에 50 mg을 혼합 / ㎖ 루시페린 준비 (1 : 4 v / v)로 얼음에 저장합니다. 참고 :이 제제는 4 ° C에서 점성 해결책으로 제시하고, 즉시 37 ° C에서 조직과 접촉시 겔화집니다.
  4. 직접 경동맥의 노출 된 부분에 냉장 루시페린 / 플루 혼합물의 200 μl를 적용하고 젤의 견고 함을 확인합니다.
  5. IVIS 스펙트럼 촬상 장치의 챔버 내의 앙와위로 동물을 넣고 안면 마스크 이소 플루 란으로 마취를 유지한다.
  6. acquisiti에서제어판 창에서 (거리를 반대하는 6.6 cm 카메라) 위치 "B"를 선택합니다 (이미지, 버전 4.2 이상을 생활) 각각 "시야"와 "비닝 (binning)"라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 요소 "매체"비닝. 주제 높이 상자에 "2.5 cm"를 입력합니다. "노출 시간"상자에 시간의 단위로 "분"을 선택하고, "2"의 숫자 값을 선택합니다.
  7. 세 분 루시페린 / 플루 겔 도포 후, 화면에 "획득"버튼을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 참고 : 이미지 획득 시간은 예상 신호 강도에 따라 1에서 6 분에 따라 다를 수 있습니다.
  8. 이미지를 획득 한 후 식염수로 젤을 씻어 멸균 거즈면 어플리케이터로 periarterial 공간을 가볍게 두 드리십시오.
  9. Vicryl 봉합사 스테이플 피부에 상처를 닫습니다.
  10. 동물을 복구 및 케이지로 돌아갑니다. 나중에 t에서 반복 영상IME 포인트 스텐트 고정화 광고 벡터에 의해 초래 동맥 발현의 시간 경과를 연구.
  11. 또한, 루시페린의 전신 투여 이미징을 수행합니다. 마취 및 9.1-9.2에 따라 동물을 예비 학교. 수술 테이프와 24 G 카테터 및 보안 카테터 꼬리 정맥 카테 테르를 꽂다.
  12. PBS에서 루시페린의 용액 (50 ㎎ / ㎖)을 제조하고 10 초 간격으로 카테터를 통해 용액 1 ㎖를 주입. 주사 후 한 분은 9.7-9.8 당 이미지 수집을 시작합니다. 참고 : 빠른 주입 속도는 (<10 초) 발작 및 호흡 정지를 유발할 수 있습니다. 발작 또는 호흡 정지가 촬영 중에 발생하는 경우 동물은 안락사해야합니다.
  13. 단계 9.10을 따르십시오.

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결과

벡터 출시 실험

이러한 혈관 내 스텐트 같은 중재 장치를 포함하는 임플란트의 표면에 아데노 바이러스 벡터의 테 더링 부분적 벡터 '물리적 타겟팅의 부족을 미연에 방지, 질병 사이트 벡터 가깝다. 그러나, 표적 조직의 형질 도입을 통해 치료 효과를 달성 할 수 있도록, 벡터는 표면 (도 2)로부터 방출되어야한다. 가수 분해성 가교제의 사용은 가교 결합제의 가수 분해에 의해 매개되는 한 벡터의 효과적인 부착 변성 polybisphosphonate하는), 티올 설치된 금속 임플란트 및 2) 서방 있도록 가정 하였다.

유도체 화 과정의 끝에서 메쉬 디스크와 연관된 광고 eGFP는 벡터의 게놈 사본 수는 eGFP는-특이 적 프라이머 (도 3)와 바이러스 DNA의 PCR에 의해 결정된다. 에 따라특정 가교 결합제는 결합...

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토론

제시된 프로토콜은 스테인레스 스틸 표면 무 코팅하는 아데노 바이러스 벡터를 통해 달성 가역적 부착 기판 매개 된 유전자 전달에 대한 동작 방법을 설명한다. 혈관 재 협착의 스텐트 기반 유전자 치료의 특정 목적을 위해 개발 된 반면,이 기술은 생체 재료, 바이오 메디컬 임플란트 및 유전자 치료 등의 분야에서의 더 넓은 응용을 갖는다.

제시된 연구는 유일하게 원형 금속 기판으로 스테인레스 스틸을 사용하고 있지만, PABT는 비교 친화력 코발트 / 크롬과 니티놀과 같은 다른 금속 합금을 결합 (게시되지 않습니다). 금속과 PABT의 indiscriminant 상호 작용은 크게이 기술 31에 대한 잠재적 인 생물 의학 응용 프로그램의 수를 확장합니다. 또한, HC-닿는 유전자 벡터의 사용은, 소재 표면에 티올 설치하는 다른 방법을 필요이라도 다른 종류의 생체 물질과 가능하다.

광고 유전자 벡터, 사람의 세포 유형과 조직에 강력한 전달을 달성하는 ...

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공개 사항

이 논문에 제시된 프로토콜 개발 및 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금(IF 0735110N 및 MC 10SDG4020003), 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 보조금 HL 72108(RJL) 및 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 T32 007915(SPF)의 지원을 받았습니다. 혈관성형술 카테터는 NuMED(Hopkinton, NY)에서 친절하게 기증했습니다. 저자는 수잔 컨스 씨의 비서 지원에 감사를 표합니다.

감사의 글

저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
316 스테인레스 스틸 메쉬 디스크Electon 현미경 과학E200-SS
일반 304 등급 스테인레스 스틸 스텐트레이저사용자 정의 주문
AdeGFP펜실베니아 대학교 벡터 코어AD-5-PV0504
AdLuc펜실베니아 대학교 벡터 코어AD-5-PV1028
AdEMPTYUniversity of Pennsylvania Vector CoreA858
Cy3(NHS)2GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
UV 96-well platesCostar3635
Fluorometry 96-well platesCostar3915
세포 배양 96-웰 플레이트Falcon353072
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
분광광도계분자 장치 SpectraMax 190
분광 플루오미터분자 장치SpectraMax Gemini EM
Orbital shaker 인큐베이터VWR1575R
수평 공기 흐름 오븐Shel Lab1350 FM
Centra-CL2 원심분리기 International Equipment Company426
디지털 소용돌이 믹서기Fisher Thermo Scientific02-215-370
Eclipse TE300 형광 현미경Nikon TE300
DC 500 CCD 카메라LeicaDC-500
7500 Real-Time PCR 시스템Applied Biosystems사용할 수
IVIS Spectrum 생물 발광 스테이션Perkins-Elmer사용할 수
EDTA 디칼륨 염Sigma-AldrichED2P
소 혈청 알부민 분획 V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
Dumont 펜치파인 사이언스 툴11255-20
A10 세포주 ATCCCRL-1476
소 대동맥 내피 세포LonzaBW-6002
루시페린, 칼륨 염금 생명 공학LUCK-1GE
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
칼슘 및 마그네슘 없음 PBSGibco14190-136
태아 소 혈청쌍둥이 자리 바이오 제품100-106
페니실린/스트렙토마이신 용액Gibco11540-122
DMEM, 고포도Corning cellgro10-013-CV
0.25% 트립신/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA 마이크로 키트Qiagen56304
Power Sybr Green PCR 마스터 믹스Applied Biosystems4367659
MicroAmp Optical 96-well 반응 플레이트Applied BiosystemsN8010560
MicroAmp 광학 접착 필름Applied Biosystems4360954
Cephazolin Apotex는사용할 수
Loxicom (Meloxicam)Norbrook사용할 수
Heparin sodiumAPP Pharmaceuticals는사용할 수
Ketavet(케타민)VEDCO는 사용할 수
Anased (Xylazine) Lloid사용 불가
Forane (Isoflurane) Baxter는 사용할 수
곡선 Moria 홍채 집게Fine Science Tools11370-31
곡선 극세 Graefe 집게Fine Science Tools11152-10
Dumont #5 집게Fine Science Tools11252-20
Vannas 스프링 가위Fine Science Tools15018-10
Fine Scissors - ToughCutFine Science Tools14058-09
수술용 가위Fine Science Tools14101-14
Vicryl 봉합사 (5-0)EthiconJ385
봉합사 실 (4/0 실크) Fine Science Tools18020-40
Michel 봉합사 클립Fine Science Tools12040-02
상처 확장기 (Lancaster eye specula)KLSMartin34-149-07
핫 비드 살균기Fine Science Tools18000-45
Michel 봉합사 클립 애플리케이터Fine Science Tools112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV 카테터Beckton-Dickinson381412
2F Fogarty 카테터Edwards Lifesciences120602F
테프론 튜빙Vention041100BST
PTA 카테터NuMed맞춤 주문
거즈 패드Kendall Healthcare9024
Cotton 애플리케이터Solon ManufacturingWOD1003
식염수Baxter281321
10 ml 주사기 (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
1 ml 주사기 (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
클리퍼스 #40 블레이드Oster 78005-314
Transpore 수술 테이프3MMM 15271
Puralube 수의사 연고Pharmaderm을 사용할 수
없음없음당 없습니다은 없습니다없습니다없습니다없음 없습니다.

참고문헌

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