이 연구는 스텐트의 코팅이 없는 금속 표면에 아데노바이러스 유전자 벡터의 가역적 부착을 보고하고 메쉬 디스크를 모델링합니다. 벡터 고정화에 사용되는 cross-linker의 가수분해에 따라 transduction-competent 바이러스 입자가 지속적으로 방출되면 혈관 세포와 스텐트 동맥에서 내구성 있는 부위 특이적 transgene 발현이 발생합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
가수 분해 크로스 링커를 통해 아데노 바이러스 벡터 닿는를 사용하여 금속 스텐트 표면에서 혈관 유전자 전송
이 논문에서
요약
초록
스텐트 재 협착 널리 관상 동맥 및 말초 동맥의 매우 좁은 부분을 통해 다시 설정 혈액의 흐름에 사용되는 스텐트 기반 재 시술 절차의 주요 합병증을 선물한다. 대안 전략을 제시 할 수있다 방지 재 협착 활성 유전자의 조정 릴리스 할 수있는 혈관 내 스텐트는 현재 약물 방출 스텐트를 사용합니다. 일반적으로 벡터의 물리적 포획을 위해 사용되는 폴리머 코팅과 관련된 과도한 염증 반응을 피하면서 임상 변환을 달성하기 위하여, 유전자 스텐트는 스텐트 고정화 유전자 벡터 방출 및 혈관의 부위 - 특이 적 전달의 예측 동력학을 나타낸다한다. 이 논문은 비스포스포네이트 (PABT)이 가수 분해 가교제 (HC)를 통해 스테인리스 표면을 개질 된 폴리 알릴 아민하는 아데노 바이러스 입자의 가역적 인 결합을 기반으로 스텐트에 아데노 바이러스 유전자 벡터의 무 코팅 테 더링에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 의 가족5 내지 오십일 레인 징의 쇄상 에스테르 가수 분해의 평균 t와 2 관능 성 (아민 - 및 티올 - 반응성) HC는 스텐트 벡터를 연결하기 위해 사용되었다. 벡터 고정화 절차는 일반적으로 9 시간 이내에 수행하고 여러 단계로 구성된다 : PABT (4 시간)의 수용액에 금속 샘플 1) 배양; 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (20 분 간격)으로 설치 PABT 티올 기, 2) 탈; 피리 딜 디티 (PDT) 그룹 (2 시간)과 폴리에틸렌 이민 유도체와 샘플을 반응시켜 금속 표면의 반응성 티올 용량 3) 확장; 디티 오 트레이 톨 (10 분)에 PDT와 티올 기의 4) 변환; HC (1 시간)와 아데노 바이러스의 5) 수정; 크기 배제 칼럼 크로마토 그래피 (15 분) 및 티올 철강 표면 (1 시간)에 티올 반응성 아데노 바이러스 입자의 7)에 의해 수정 고정화 아데노 바이러스 입자의 6)의 정제. 이 기술은 스텐트를 넘어 폭 넓은 잠재적 인 응용 성을 가지고주입 된 이물질 인터페이싱 세포 기질 - 매개 유전자 전달을 통해 자신의 생체 적합성을 향상시키기 위해 판막 장치의 표면 공학을 촉진시켜.
서론
치료 적 양상과 같은 유전자 치료의 효과는 유전자 치료 벡터의 1,2 나쁨 타겟팅 용량에 의해 방해된다. 목표 위치에 유전자 발현의 하위 치료 수준에서 적절한 타겟팅 결과 부족하고, 벡터 및 부호화 치료 제품 4 모두에 대하여 면역 반응을 마운팅 할 책임을 포함한 비 - 표적 기관 03 행 벡터의 넓은 보급에 이르게 5. 하나의 가능성은 전달의 성행위를 상쇄하고 타겟팅 혈액과 림프를 통해 자신의 무료 보급을 배제 형태로 원하는 위치에 유전자 벡터를 소개하는 홍보하는 것을 의미한다. 전형적으로, 이러한 노력들은 물리적 번째 포획하여 주사 부위에서 일시적으로 유지하는 유전자 벡터 수있는 피브린, 콜라겐이나 히알루 론산 하이드로 젤 매트릭스 6-10과 혼합 바이러스 성 또는 비 바이러스 벡터 중 구성된 국소 주사 전달 시스템에 의존고분자 네트워크의 그들.
지역화 된 유전자 치료를위한 또 다른 일반적으로 인정 패러다임 주입 보철 장치 (11, 12)의 표면에 유전자 벡터의 고정화를 이용한다. 영구 이식 의료 (혈관, 기관지, 비뇨기과 및 위장 스텐트, 심장 박동기, 인공 관절, 수술 및 부인과 메시, 등....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
릴리스 실험에 대한 Cy3가 표지 된 아데노 바이러스의 1 준비
- (; 산도 9.3 CBB) 탄산염 / 중탄산염 버퍼 650 ㎕의 빈 광고의 2 × 10 12 입자 (약 2 × 10 11 감염성 단위)를 일시 중단합니다.
- 0.2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 (2 인 Cy3 (NHS)) 1 ml의 CBB의 아민 반응성 형광 염료의 1 바이알 (0.2 mg)의 내용을 녹인다.
- 5 초 동안 바이러스 서스펜션, 소용돌이에 염료 용액 100 μl를 추가하고 (100 ~ 200 RPM)을 흔들어으로 28 ° C에서 1 시간 동안 배양한다.
- PBS와 20 ㎖의 파로스 6B 열 평형. Cy3가 표지 광고 서스펜션 드롭 현명한 겔 침대의 중심의 750 μl를 추가합니다.
- 바이러스 현탁액은 수지를 투과 한 후, PBS 5 ㎖를 추가한다. 용출액을 폐기하십시오.
- PBS의 0.5 ML을 추가하고 레이블이 유리 용기에 용출액을 수집합니다. 열 0.5 ml의 분수의 총 수집이 단계의 10 배를 반복합니다.
- 분석 일전자는 바이러스 성 DNA 콘텐츠에 대한 분광 광도계 (260 및 280 nm의)에 의해 분수를 수집.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
벡터 출시 실험
이러한 혈관 내 스텐트 같은 중재 장치를 포함하는 임플란트의 표면에 아데노 바이러스 벡터의 테 더링 부분적 벡터 '물리적 타겟팅의 부족을 미연에 방지, 질병 사이트 벡터 가깝다. 그러나, 표적 조직의 형질 도입을 통해 치료 효과를 달성 할 수 있도록, 벡터는 표면 (도 2)로부터 방출되어야한다. 가수 분해성 가교제의 사용은 가교 결합제의 가수 분해에 의해 매개되는 한 벡터의 효과적인 부착 변성 polybisphosphonate하는), 티올 설치된 금속 임플란트 및 2) 서방 있도록 가정 하였다.
유도체 화 과정의 끝에서 메쉬 디스크와 연관된 광고 eGFP는 벡터의 게놈 사본 수는 eGFP는-특이 적 프라이머 (도 3)와 바이러스 DNA의 PCR에 의해 결정된다. 에 따라특정 가교 결합제는 결합.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
제시된 프로토콜은 스테인레스 스틸 표면 무 코팅하는 아데노 바이러스 벡터를 통해 달성 가역적 부착 기판 매개 된 유전자 전달에 대한 동작 방법을 설명한다. 혈관 재 협착의 스텐트 기반 유전자 치료의 특정 목적을 위해 개발 된 반면,이 기술은 생체 재료, 바이오 메디컬 임플란트 및 유전자 치료 등의 분야에서의 더 넓은 응용을 갖는다.
제시된 연구는 유일하게 원형 금속 기판으로 스테인레스 스틸을 사용하고 있지만, PABT는 비교 친화력 코발트 / 크롬과 니티놀과 같은 다른 금속 합금을 결합 (게시되지 않습니다). 금속과 PABT의 indiscriminant 상호 작용은 크게이 기술 31에 대한 잠재적 인 생물 의학 응용 프로그램의 수를 확장합니다. 또한, HC-닿는 유전자 벡터의 사용은, 소재 표면에 티올 설치하는 다른 방법을 필요이라도 다른 종류의 생체 물질과 가능하다.
광고 유전자 벡터, 사람의 세포 유형과 조직에 강력한 전달을 달성하는 .......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
이 논문에 제시된 프로토콜 개발 및 연구는 미국 심장 협회 과학자 개발 보조금(IF 0735110N 및 MC 10SDG4020003), 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 보조금 HL 72108(RJL) 및 미국 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소 T32 007915(SPF)의 지원을 받았습니다. 혈관성형술 카테터는 NuMED(Hopkinton, NY)에서 친절하게 기증했습니다. 저자는 수잔 컨스 씨의 비서 지원에 감사를 표합니다.
감사의 글
저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 316 스테인레스 스틸 메쉬 디스크 | Electon 현미경 과학 | E200-SS | |
| 일반 304 등급 스테인레스 스틸 스텐트 | 레이저 | 사용자 정의 주문 | |
| AdeGFP | 펜실베니아 대학교 벡터 코어 | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | 펜실베니아 대학교 벡터 코어 | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| 세포 배양 96-웰 플레이트 | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| 분광광도계 | 분자 장치 | SpectraMax 190 | |
| 분광 플루오미터 | 분자 장치 | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker 인큐베이터 | VWR | 1575R | |
| 수평 공기 흐름 오븐 | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 원심분리기 | International Equipment Company | 426 | |
| 디지털 소용돌이 믹서기 | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 형광 현미경 | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD 카메라 | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR 시스템 | Applied Biosystems | 사용할 수 | |
| IVIS Spectrum 생물 발광 스테이션 | Perkins-Elmer | 사용할 수 | |
| EDTA 디칼륨 염 | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| 소 혈청 알부민 분획 V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont 펜치 | 파인 사이언스 툴 | 11255-20 | |
| A10 세포주 | ATCC | CRL-1476 | |
| 소 대동맥 내피 세포 | Lonza | BW-6002 | |
| 루시페린, 칼륨 염 | 금 생명 공학 | LUCK-1GE | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| 칼슘 및 마그네슘 없음 PBS | Gibco | 14190-136 | |
| 태아 소 혈청 | 쌍둥이 자리 바이오 제품 | 100-106 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 용액 | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, 고포도 | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% 트립신/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA 마이크로 키트 | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR 마스터 믹스 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well 반응 플레이트 | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp 광학 접착 필름 | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex는 | 사용할 수 | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | 사용할 수 | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals는 | 사용할 수 | |
| Ketavet(케타민) | VEDCO | 는 사용할 수 | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | 사용 불가 | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | 는 사용할 수 | |
| 곡선 Moria 홍채 집게 | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| 곡선 극세 Graefe 집게 | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 집게 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas 스프링 가위 | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine Scissors - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| 수술용 가위 | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl 봉합사 (5-0) | Ethicon | J385 | |
| 봉합사 실 (4/0 실크) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel 봉합사 클립 | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| 상처 확장기 (Lancaster eye specula)KLS | Martin | 34-149-07 | |
| 핫 비드 살균기 | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel 봉합사 클립 애플리케이터 | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24 G IV 카테터 | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty 카테터 | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| 테프론 튜빙 | Vention | 041100BST | |
| PTA 카테터 | NuMed | 맞춤 주문 | |
| 거즈 패드 | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton 애플리케이터 | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| 식염수 | Baxter | 281321 | |
| 10 ml 주사기 (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml 주사기 (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| 클리퍼스 #40 블레이드 | Oster | 78005-314 | |
| Transpore 수술 테이프 | 3M | MM 15271 | |
| Puralube 수의사 연고 | Pharmaderm | 을 사용할 수 |
참고문헌
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
