방법 논문

ATP에 의존 염색질 리모델링 효소의 활동을 분석하는 생화학 분석 실험

DOI:

10.3791/51721

⸱

2014년 10월 25일

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

이 논문에서

요약

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여기에서는 ATP 의존성 염색질 리모델링 효소의 능력을 특성화하는 데 사용할 수 있는 생화학적 분석법을 설명합니다. 1) ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩을 촉매하고, 2) 뉴클레오솜 기질과 결합하고, 3) 뉴클레오솜 또는 DNA 의존성 방식으로 ATP를 가수분해합니다.

초록

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SNF2 계열의 구성원은 종종 ATP 의존성 뉴클레오솜 리모델링을 촉매하여 뉴클레오솜 역학 및 DNA 접근성을 조절하는 다중 소단위 염색질 리모델링 복합체의 구성 요소로 기능합니다. 다단계 ATP 의존성 염색질 리모델링 반응에 대한 이러한 복합체의 개별 소단위의 기여를 생화학적으로 해부하려면 반응 생성물의 생산을 모니터링하고 반응 중간체의 형성을 측정하는 분석을 사용해야 합니다. 이 JOVE 프로토콜은 다양한 서브유닛 조합을 포함하는 염색질 리모델링 복합체 또는 서브 컴플렉스의 생화학적 활성을 측정할 수 있는 분석을 설명합니다. 염색질 리모델링은 전기영동 이동성 이동 분석법(EMSA) 기반 방법을 사용하여 DNA 분자에서 뉴클레오솜의 움직임을 모니터링하는 ATP 의존성 뉴클레오솜 슬라이딩 분석을 사용하여 측정됩니다. 뉴클레오솜 결합 활성은 유사한 EMSA 기반 방법을 사용하여 리모델링 복합체 결합 단뉴클레오솜의 형성을 모니터링하여 측정하고, DNA 또는 뉴클레오솜 의존성 ATPase 활성은 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하여 DNA 또는 뉴클레오솜이 존재할 때 ATP가 ADP 및 인산염으로 전환되는 속도를 측정합니다. 이러한 분석을 사용하여 전체 복합체의 활동을 하나 이상의 소단위가 없는 활동과 비교하여 염색질 리모델링 복합체의 소단위의 기능을 조사할 수 있습니다. 인간 INO80 염색질 리모델링 복합체가 예로 사용됩니다. 그러나, 여기에 기술된 방법은 다른 염색질 리모델링 복합체의 연구에 적용될 수 있다.

서론

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SNF2 가족 염색질 리모델링 단지는 중앙 SNF2 같은 ATPase의 서브 유닛 1, 2를 포함한다. 단일 서브 유니트 효소와 같은 일부 SNF2 형상 ATPases 기능, 다른 큰 멀티 소단위 복합체 촉매 서브 유닛으로서 기능하는 동안. 리모델링 복합체가 그들의 활동에 기여 염색질의 서브 유니트 각각은 리모델링 과정을 해부 생화학 분석을 수행 할 수있는 능력을 필요로하는 분자 메커니즘을 해명.

인간 INO80 착물 및 기타 염색질 개조 효소에 의해 ATP 의존적 뉴 클레오 리모델링은 그 DNA- 및 / 또는 뉴 클레오 의존적 ATPase를 활성화 한 후, 뉴 클레오로 리모델링 효소의 결합을 시작하는 다단계 과정으로 구상 될 수있다 뉴 클레오 솜 DNA, 그리고 뉴 클레오 1,2의 최종 위치 조정에 리모델링 효소의 전위. ATP 의존적 크로 마틴 리모델링 프로세스 (R)의 분자 세부 사항을 이해반응의 각 단계에 크로 마틴 리모델링 복합체의 개별 서브 유닛의 기여의 리모델링의 각 단계에 대한 반응 및 정의의 절개를 equires. 이런 분석은 in vitro에서 정의 된 분자의 기판을 사용하여 뉴 클레오 리모델링 및 기타 활동을 분석 할 수있는 능력을 필요로한다.

이전 조브 프로토콜에서, 우리는 정의 서브 유닛 조성 3 INO80 크로 마틴 리모델링 복합체 및 서브 콤플렉스를 생성하는 데 사용되는 절차를 설명했다. 여기서 우리는, DNA- 및 뉴 클레오-ATPase의 활성화, 이러한 복합체와 관련된 뉴 클레오 리모델링 활동을 결합 뉴 클레오의 정량 분석​​을 가능하게 세 가지 생화학 적 분석을 제시한다.

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프로토콜

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1 ATP에 의존하는 뉴 클레오 리모델링 분석 실험

뉴 클레오 리모델링 활동 ATP-의존성을 측정하기 위해, INO80를 immunopurified 또는 INO80의 서브 콤플렉스는 ATP와 216 bp의, 32 P-표지 된 DNA 단편의 일 단부에 위치하는 단일 뉴 클레오를 포함 mononucleosomal 기판과 함께 배양된다. 반응 생성물은 다음 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 전기 영동한다.

  1. 32 P-표지 된 ', 601'DNA 단편을 생성하기에서 증폭을 pGEM-3Z-601 4 올리고 뉴클레오티드로서 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG 및 5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG을 사용하여 최종 위치 (601) 뉴 클레오 솜 위치 서열을 포함하는 216 염기쌍의 DNA 단편, 순방향 및 역방향 프라이머.
    1. 표 1에 기재된 바와 같이 100 ㎕의 PCR 반응을 설정한다.
    2. 다음 프로그램을 사용하여 서열 증폭기에서 PCR 반응을 수행하여 1 분을 96 ° C, followe에서94 ° C, 57 ° C, 30주기 동안 72 ° C에서 60 초에서 30 초에서 45 초만큼 D; 72 ° C에서 7 분으로 끝나는.
    3. PCR 반응이 완료되면, 클레아없는 스핀 컬럼을 통해 회 반응 생성물을 통과하여 통합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거한다.
    4. PCR 반응은 원하는 ~ 216 염기쌍의 DNA 단편을 생성 된 것을 확인하는 1.2 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 PCR 산물의 5 μL를 실행.
    5. 정제 된 PCR 생성물 20 배량의 5 μL 희석하고 UV 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 평균 수율은 ~ 40 NG / μL이다.
    6. 섬광 계수기에서 정제 된 PCR 생성물의 1 μL의 방사능을 측정한다. 노출 당 비용 (CPM) / NG를 계산하여 라벨 효율을 추정한다. 성공적인 라벨링 반응물을 601 DNA 단편 ~ 15,000 CPM / NG을 수득 할 것으로 예상된다.
  2. 용액을 희석 방법 5를 사용하여 표시 601 DNA에 헬라 세포 뉴 클레오을 전송합니다.
    1. 2 pmol의 혼합32 P-표지 된 601 DNA 단편 헬라 뉴 클레오 6 μg 1.0 M의 NaCl, 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF 및 1 ㎜를 포함하는 완충액 50 μL에 (같이 제조 5 참조) DTT와 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다.
    2. 순차적 0.8 M, 0.6 M로 혼합물을 희석하고, 10 mM Tris-HCl (pH8.0)을, 1 mM의 EDTA, 0.1 mM의 PMSF의 각각 12.5 μL, 20.8 μL, 41.6 μL, 희석 0.4 M의 NaCl, 및 1 mM의 DTT, 각 희석 한 후 30 ° C에서 30 분 배양과 함께.
    3. 또한 30 분 동안 배양하여 다음 0.1 % Nonidet P-40, 20 % 글리세롤, 및 200 μg / ㎖ BSA를 함유하는 동일한 완충액 250 μL을 125 μL 첨가함으로써, 0.1 M의 NaCl로 한 다음 0.2 M 및로 혼합물을 희석 마지막이 희석 사이에 30 ° C에서. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 mononucleosome 기판을 저장합니다.
  3. 10 μL의 총 부피에 ATP에 의존하는 뉴 클레오 슬라이딩 반응을 수행합니다. 정말이에요INO80 뉴 클레오 리모델링 활성을위한 최적의 NaCl 농도이기 때문에 ction의 구성 요소. 표 2에 나와있는 것은 ~ 50 mM의 염화나트륨 (미발표 결과), 고려에 함유 된 염화나트륨의 양을 가지고, 50 mm의 각 반응에서의 NaCl의 총 농도를 조정 뉴 클레오 효소의 준비.
    1. 분석을 설정하기 시작하기 전에 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤 (18 X 16cm)를 캐스팅. 5 %의 아크릴 아미드를 함유 한 겔을 제조 (아크릴 아미드 : 37.5 비스 아크릴 아미드 : 1), 0.5의 TBE (45 mM 트리스 보레이트, 1 mM의 EDTA), 0.01 %과 황산 암모늄 (APS), 및 0.001 % N, N, N', N'의 -tetramethylethylenediamine (TEMED는). 표 3에 나와있는 재료를 혼합 겔을 실온에서 적어도 2 시간 동안 중합하도록 허용합니다.
    2. 각각의 반응을 수행하는 한편, 프리 실리콘이 냉장 된 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 ~ 20 nM의 INO80 또는 INO80의 subcomplex에 결합 (EB100 버퍼의 양 (같이 제조 3 참조) 충분한 표 4) 4.75 μL의 부피를 수득 하였다. 가루 즉시 드라이 아이스 또는 액체 질소에 남아 INO80 - 함유 분획을 다시 동결.
    3. 'X'의 요소에 의해 확장, 나머지 재료와 함께 마스터 칵테일을 설정합니다 (여기서 반응의 X = 총 세). 단일 10 μL 반응에 필요한 각 성분의 양은 표 5에 열거한다; 레시피가 수행되는 반응의 수에 따라 확장 할 것이다. Pipetman와 튜브를 눌러 또는 피펫 팅 의해 아래로 잘 섞어 벤치 탑의 microcentrifuge에 몇 초 동안 튜브를 회전.
    4. 단계 1.3.2에서 설정 반응 관 각각에 마스터 칵테일 5.25 μl를 분배. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 30 ° C 열 블록 또는 물을 욕조에 반응 튜브를 전송하여 반응을 시작하고 2 시간 동안 배양한다.
    5. 한편, 경쟁 DNA를 포함하는 칵테일 '믹스를 제거하는'준비와 뉴 클레오는 X (반응 + 4 X = 총)의 요인에 의해 확장. 단일 반응 혼합물을 1.5 ㎕의 제거를 준비하기 위해 필요한 각 성분의 양을 표 6에 열거한다; 레시피가 수행되는 분석의 수에 따라 확장 할 것이다.
    6. 제거 믹스의 1.5 μl를 첨가하여 반응을 종료합니다. 잘 믹스 스핀 다운, 그리고 추가로 30 분 동안 30 ° C에서 배양.
    7. 한편, 일정한 버퍼 순환을 유지하기 위해 하부 챔버 내부의 자기 교반 막대 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여, 4 ° C에서 30 분 동안 100 V에서 수직 전기 영동 장치의 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔을 미리 실행합니다.
    8. 샘플을로드 배 TBE, 30 % 글리세롤, 0.25 % 브로 모 페놀 블루, 0.25 % 크실렌 Cyanol FF를 포함 로딩 염료의 2.5 μl를 추가합니다. 간단히 샘플을 회전, 잘 혼합, 및로드 정보를 사용하여 겔에로드합니다.
    9. 버퍼 순환 4 ° C에서 4.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행합니다.
    10. 신호를 검출하기 위해, 여과지의 두 시트의 스택 겔 옮긴다. 투명한 플라스틱 포장을 사용하여 상단에있는 겔 필터 종이 랩, 다음 원하는 시간 동안 4 ° C에서 저장 형광체 화면에 노출.
    11. 동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 검색하고 적합한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.

2 Mononucleosome 결합 분석

mononucleosomes위한 소정 INO80 복합체의 결합 친화도 분석법을 위해, 단계 120에서 생성 mononucleosomal 기판을 이용한 전기 영동 이동성 시프트 분석법 (EMSA)을 수행.

  1. 반응은 뉴 클레오 리모델링 분석에 대해 설명하지만 반응에서 ATP 및 제거 믹스를 생략으로 분​​석을 바인딩 믹스 설정; 30 분 동안 30 ° C에서 배양한다.
  2. 각 반응 혼합물에 로딩 염료의 2.5 μl를 추가하고, 3.5 %의 아크릴 아마이드 (아크릴 아미드가 포함 된 기본 폴리 아크릴 아마이드 겔에 적용 : 세 비스7.5 : 1), 1 % 글리세롤, 0.5 배의 TBE, 0.01 %의 APS 및 0.001 % TEMED.
  3. 버퍼를 실행으로 0.5 배의 TBE를 사용하여 버퍼 순환 4 ° C에서 2.5 시간 동안 200 V에서 젤을 실행하고 저장 형광체 화면에 노출.

3 DNA- 및 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 실험

20 mM 트리스 - 염산 (pH를 7.5), 60 mM의 염화나트륨, 6.6 mM의 MgCl2를, 0.8 mM의 EDTA, 0.015 % Nonidet P-40, 2.5 % 글리세롤, 0.1 ㎎ / ㎖ BSA, 1을 포함하는 5 ㎕의 반응 혼합물에 ATPase를 세이를 수행 mM의 DTT, 0.1 mM의 PMSF, 2 mM의 ATP [α- 32 P] ATP의 2 μCi (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. INO80 단지의 각 INO80의 복잡하거나 시간 동안 원형 플라스미드 DNA 측정 (5,000 bp의, ~ 30 nm의) 폐쇄 함유 DNA- 또는 뉴 클레오 독립적 ATPase의 하나를 측정하는 세 병렬 반응, 일 포함 EB100 버퍼를 설정 정량 할 DNA- 의존적 ATPase를, 및 뉴 클레오 의존적 ATPase를 측정하는 한 헬러 oligonucleosomes (~ 185 나노 미터)을 포함. 얼음에 모두 반응을 설정합니다.

  1. 각 반응의 경우, 사전 냉장 윤활 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 2.2 μL의 볼륨을 제공하기에 충분 EB100 버퍼의 양 immunopurified INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 10 ~ 50 nm의 결합. 가루 즉시 드라이 아이스 또는 액체 질소에있는 INO80 - 함유 분획을 다시 동결.
  2. 마스터 칵테일을 설정합니다. 단일 반응에 필요한 각 성분의 양을 표 7에 표시됩니다. X는 = INO80 준비의 수를 정량 할 3 (X + 2) 하나의 요인에 의해 확장하여 조리법을 확장 할 수 있습니다.
  3. '서브 칵테일'포함 버퍼를 준비하려면 만, DNA, 또는 뉴 클레오는 3 개의 별도의 튜브에 마스터 칵테일의 2.5 (X + 2) μl를 분배. 0.3 어느 EB100의 (X + 2) μL 폐쇄 원형 플라스미드 DNA (1.5 μg / μL), 또는 헬라 oligonucleosomes (1.5 μg / μL)을 넣고 잘 섞는다.
  4. 성에서 설정 한 효소 함유 반응 튜브에 적절한 서브 칵테일의 2.8 μl를 분배EP 3.1. 부드럽게 섞어 아래로 피펫; 거품을 도입하지 마십시오.
  5. , 반응을 시작하는 30 ° C 열 블록에 반응 튜브를 전송합니다.
  6. 적어도 1.5 cm 떨어진 하단 가장자리로부터 직선 5, 15, 30, 및 인큐베이션 60 분 후, 셀룰로스 폴리에틸렌 박층 크로마토에 각각 반응 혼합물의 0.5 ㎕를 스팟 (TLC) 플레이트 (20 × 10cm) . 바로 그래서 여러 시점이 하나의 튜브에서 취할 수 있습니다 30 ° C 열 블록에 반응 튜브를 반환합니다. 스포팅 후, 타격 건조기를 사용하여 TLC 판을 건조.
  7. TLC 플레이트의 하단은 0.5 cm 용액에 침지 될 수 있도록 충분히 0.375 M 인산 칼륨 (pH를 3.5)를 함유하는 유리 챔버 TLC 플레이트를 옮긴다.
  8. 챔버를 포함하고, 액상의 전면 TLC 플레이트의 상단에 도달 할 때까지 개발한다. 즉시 철저하게 타격 건조기를 사용하여 판을 건조.
  9. RT에서 저장 형광면에 건조 TLC 판을 노출.동위 원소 촬상 스캐너 시스템의 화면을 스캔 방사성 ATP와 ADP 기판 생성물의 양을 결정한다.
  10. 가수 분해 ATP의 양을 계산하기 위하여, 다음과 같은 수식을 사용하여 개시, 반응 혼합물 중의 ATP 존재하는 양에 의해 가수 분해 %의 ATP를 곱 pmol의의 ATP 가수 분해 = 10 pmol의의 ATP를 반응 X 개시까지 [ADP / (ATP + ADP)]

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결과

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수치는 뉴 클레오 슬라이딩 (그림 1) 및 바인딩 (그림 2) 분석 및 DNA- 또는 뉴 클레오 의존 ATPase의 분석 (그림 3)을 포함 INO80 활동을 특성화하는 데 사용되는 생화학 적 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다.

그림 1의 실험은 그대로 INO80 단지의 능력 FLAG-Ies2 또는 FLAG-INO80E을 통해 정제 INO80은 216 BP, 방사성 동위 원소 표지 된 DNA 단편 조립 mononucleosomes의 리모델링을 촉진하기 위해 FLAG-Ino80ΔN 또는 Ino80ΔNΔHSA 중 하나를 통해 정제 서브 콤플렉스의 비교합니다. DNA 단편의 뉴 클레오 솜의 위치는 전기 이동성에 영향을 미칩니다 측면에 위치 뉴 클레오 빨리 더 중앙에 위치 뉴 클레오보다 젤에서 실행합니다. INO80 염색질 리모델링 복합체가 우선적으로 DNA

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토론

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, 그리고 리모델링 및 / 또는 ATPase의 효소 오염에 우리가 분석에서 관찰하는 뉴 클레오 리모델링 및 ATPase의 활동 INO80 복합체의 촉매 활성에 따라 보장하기 위해, 우리는 정기적으로 분석 뉴 클레오 리모델링 및 INO80 단지의 촉매 비활성 버전의 ATPase의 활동은 정제 야생형 INO80 동일한 절차를 사용하여 평행. INO80 착체 또는 서브 콤플렉스의 다른 제제의 액티비티를 비교하는 실험의 해석을 복잡하게 할 수 ATP 및 / 또는 ATP 독립적 리모델링 활동 오염의 존재를 테스트하는 뉴 클레오 리모델링 활성을 시금 때 ATP 결여 된 음성 대조군 반응물을 또한 수행한다. 촉매 INO80 또는 INO80 서브 콤플렉스의 비활성 버전은 더 뉴 클레오 리모델링 또는 ATPase의 활동을 전시 없습니다. 또한, 뉴 클레오 DNA- 또는 독립적 ATPase의 활성의 검출에 enzym ATPase를 (들)를 오염의 존재를 표시전자 분율. 활성은 여전히​​ 촉매 비활성 Ino80의 존재하에 검출 된 경우 또는 실질...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자 연구실에서의 연구는 미국 국립일반의학연구소(National Institute of General Medical Sciences, GM41628)의 지원과 그레이터 캔자스시티 커뮤니티 재단(Greater Kansas City Community Foundation)의 헬렌 넬슨 의학 연구 기금(Helen Nelson Medical Research Fund)의 스타워스 의학 연구소(Stowers Institute for Medical Research)의 지원으로 이루어집니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
프로테아제 억제제 칵테일시그마P8340
10x PCR 반응 완충액;Roche 응용 과학 
Roche Taq DNA 중합효소Roche Applied Science 
NucAway 뉴클레아제가 없는 스핀 컬럼 AmbionCat. # AM10070
초순수 ATP USB/Affymetrix77241 25 UM
소 세럼 알부민 시그마A9418 
40% 아크릴아미드/비스 37.5:1Amresco0254-500ML
초음파 연어 정액 DNA GE 헬스케어27-4565-01
10% 과황산암모늄 (APS)Thermo Scientific17874
벤조나제 노바젠고양이. No. 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmolPerkinElmerBLU013Z250UC
PCR 열 순환기 PTC 200MJ ResearchPTC 200
Hoefer 수직 전기영동 유닛HoeferSE600X-15-1.5
윤활 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브 Costar3207
저장 인광 스크린 분자 역학63-0034-79
3MM 여과지Whatman 28458-005VWR
태풍 인광이미저 GE Healthcare8600
ImageQuant 소프트웨어GE Healthcarever2003.02
TLC 유리판, PEI-셀룰로오스 FMillipore5725-7
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4MilliporeIPFL07810
엔드 윈도우 또는 팬케이크 GM (Geiger-Mueller) 프로브가있는 범용 측량 미터Biodex모델 14C
1143509400111435094001

참고문헌

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  15. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
  16. Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).

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EMSAATPaseINO80

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