Method Article

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

DOI:

10.3791/52056

⸱

November 6th, 2014

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

Abstract

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파골 세포는 골수 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생 된 고도로 전문화 된 세포이다. 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수하는 이들의 독특한 능력은 골 리모델링을 조절하는데 중요한 역할을한다는 것을 의미한다. 함께, 조골 세포 및 파골 세포는 골 흡수 및 건강과 질병 중에 정상 골격을 유지하기 위해 함께 작용하는 골 형성을 모두 포함 동적 커플 링 프로세스에 대한 책임이있다.

신체의 주요 뼈 재 흡수 세포로, 파골 세포의 분화 또는 기능의 변화는 몸에 심각한 영향을 초래할 수 있습니다. 변경된 파골 세포의 기능과 관련된 질환은 더 일반적으로 과도한 파골 세포의 골 흡수가 형성 골절에 걸리기 쉽게하는 골다공증 등의 병변을 관찰하기 때문에 조혈위한 골수 공간을 형성하기 위해 실패에 치명적인 신생아 질병 심각도에 다양합니다. ENT "> 체외에서 높은 숫자 파골 세포를 분리하는 능력은 뼈의 리모델링주기의 이해에 상당한 발전을 허용하고이 질병에 대처 새로운 치료 전략의 발견을위한 도로를 포장하고있다.

여기, 우리는 분리와 파골 세포의 큰 숫자를 얻을 것입니다 마우스 골수에서 파골 세포를 배양 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

Introduction

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뼈의 리모델링은 동적이며 골 흡수 1 골 형성의 커플 링을 수반한다. 이 엄격하게 규제 과정은 정상적인 항상성 동안 골격을 유지할 책임이 있으며, 부상 및 질병에 대응.

파골 세포는 뼈의 유기 및 무기 매트릭스를 모두 재 흡수 할 수있는 고유 한 다핵 세포이다. 파골 세포는 골수 2-5의 단핵구 / 대 식세포의 혈통에서 파생됩니다. 파골 세포의 기능 또는 형성에 이상이 골다공증과 같은 일반적인 조건을 포함 임상 병리의 다양한 발생할 수 있습니다.

체외에서 파골 세포를 생성하는 기능은 뼈 생물학 (6)에 대한 우리의 이해에 상당한 발전을 허용했다. 결과적으로, 새로운 치료제 7 상당한 이환율 및 사망률을 담당 파골 세포 관련 질환을 치료하기 위해 대두되고 까지. 뼈 질량과 강도의 항상성 유지는 뼈 형성 조골 세포와 뼈 재 흡수 파골 세포 8,9의 공동 행동이 필요합니다. 골 항상성이되는 파골 세포 활성은 골 질량 및 밀도 10 병원성 손실에 이르게 증가, 폐경 후 골다공증을 포함한 질병의 숫자로 변경된다. 인간 질병의 형질 전환 생쥐 모델의 유용성을 ....

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Protocol

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참고 : 윤리 문 : 척추 동물을 포함한 모든 연구가 실험 동물 관리에 스탠포드 행정 패널 (APLAC)의 승인에 따라 프로토콜을 수행 하였다.

1. 준비

  1. 시판 밀도 구배 세포 분리 매체 10 ㎖ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 RT에 와서 (polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 포함 1.077 g / ㎖의 밀도로 조정) 허용.
  2. 유동 세포 계측법 준비 (FACS)는 1X 인산 완충 식염수 (PBS)와 2 % 소 태아 혈청 (FCS)와 버퍼. 50 mL를을 가지고 밀도 구배 세포 분리 매체 단계에서 사용하기 위해 RT에서이 나누어지는을 유지한다.
  3. 분리 절차를 수행하는 동안 격리 된 조직과 세포를 유지 할 준비가 얼음 양동이를 가지고있다.

2. 문화 매체 준비

  1. 기저 미디어를 준비합니다 MEM (최소 필수 중간), 페놀 레드 (500 ㎖), 글루타민산 (1X)하지 않고, FCS를 (10 배), 10,000 단위 / ㎖ penicilliN (1X).
  2. 0.22 μm의 필터를 기저 미디어를 필터링합니다.
  3. 골수 대 식세포 유도 매체를 준비합니다
    1. 2.1 단계에서 제조....

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Results

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이 방법의 목적은 쉽게 일주 전형적, 시험관 내에서 파골 세포의 다수를 분리 하였다. 파골 세포의 다수의 성공적인 분리가 타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 염색 (도 1A)를 사용하여 확인 하였다. 큰 파골 세포는 여러 개의 핵 (일반적으로 ≥ 3 핵)와 큰 보라색의 세포로 시각입니다. 이 프로토콜을 이용하여, 파골 세포 당 30 개의 핵 (도 1b)와 파골 세포를 분리하는 것이 일반적이다.

광물 표면을 사용하여 in vitro에서 파골 세포의 재 흡수 활동을 평가하는 황금 표준 방법으로 간주됩니다.이 방법을 사용하여 형성 한 광물 표면의 비율, 또는 "재 흡수 구덩이는"파골 세포의 재 흡수 용량의 결정 (그림 2) 수 있습니다.

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Discussion

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쉽게 체외에서 파골 세포의 큰 숫자를 분리하고 배양 할 수있는 능력은 뼈 생물학 및 파골 세포 - 매개 질환의 이해를 전진하는 데 도움에 대한 책임이있다. 이는 최근 파골 세포 분화, 분화 및 생존 16-18의 주요 조절로 확인되었다 때,이 이어질 RANKL의 식별이었다.

그것은 골수에서 파골 세포의 체외 배양은 파종 밀도에 크게 의존하는 우리의 경험이었다. 우리는 골수 유래 세포를 도금시 파골 세포를 수득하고이 프로토콜 실패 차선 시딩 밀도로 인해 일반적으로 관찰. 따라서,이 프로토콜에, 이곳은 24 웰 플레이트 당 20 만 셀을 배정하는 것이 좋습니다. 또한,이 기술에 최대 성공을 달성하기 위해서는, 정확하게 파골 유도 매체를 제조 권장 위와 s로 미디어를 변경하는 바와 같은AME 시간은 매일, 초기 삼일 후에 하나는 문화 판을 방해 할 필요가없는 경우. 이는 파골 세포 유도 인자 매체의 농도를 일정하게 할 수있다. 또한.......

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Disclosures

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저자 중에 선언하는 공개 또는 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 NIH 보조금 R01 DE021683, R01 DE019434, U01 HL099776, 오크 재단과 소아 재생 의학 Hagey 연구소의 지원을 인정합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MEM, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음Gibco51200-038
M-CSF, 재조합 마우스GibcoPMC2044
재조합 마우스 TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli 발현)R& D Systems462-TEC-010
프로스타글란딘 E2Sigma-Aldrich
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
산성 인산분해효소, 레코사이트(TRAP) 키트Sigma-Aldrich387A
골분석 골흡수 플레이트, 24웰 플레이트Corning Life Sciences3987

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
  2. Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investi....

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