인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.
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방법 논문
분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC)는 줄기세포 기반 조직 공학 응용 분야의 황금 표준으로 간주됩니다. 그러나 수확해야 하는 과정은 상당한 기증자 부위 이환율과 관련이 있을 수 있습니다. 반면, 지방 유래 기질 세포(ASC)는 더 쉽게 풍부하고 더 쉽게 채취할 수 있어 BM-MSC에 대한 매력적인 대안이 됩니다. BM-MSC와 마찬가지로 ASC는 골형성 계통 세포로 분화할 수 있으며 두개안면 골격 결손에 사용하기 위해 골격에 파종하는 것과 같은 조직 공학 응용 분야에 사용할 수 있습니다. ASC는 ASC, 혈관 내피 세포 및 벽화 세포, 평활근 세포, 주위 세포, 섬유아세포 및 순환 세포의 이질적인 혼합물인 소화된 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)에서 얻습니다. 유세포 분석은 ASC에 대한 표면 마커 프로파일이 BM-MSC에 대한 표면 마커 프로파일과 유사하다는 것을 보여주었습니다. ASC 표현형에 대한 마커를 확립하는 여러 발표된 보고서에도 불구하고 이 이질적인 집단에서 골전구 세포를 식별하는 프로필에 대한 합의가 여전히 부족합니다. 이 프로토콜은 중요한 크기의 calvarial defects를 복구하기 위해 향상된 osteogenic capacity를 가진 ASC의 하위 모집단을 분리하고 사용하는 방법을 설명합니다.
서론
줄기세포 집단의 이질적인 특성은 아직 완전히 이해되지 않았으며 임상적으로 효과적인 줄기세포 기반 치료 응용 프로그램의 개발에 주요 장애물로 남아 있습니다. 이질적인 줄기세포 집단을 특성화하는 가장 일반적인 방법 중 하나는 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 같은 세포 분류 방법을 사용하여 표면 마커 발현 프로파일을 기반으로 세포를 분리하는 것입니다. 분류 방법이 더욱 복잡해짐에 따라 세포의 보다 뚜렷한 기능적 하위 집단을 식별하는 것이 가능해집니다. Microfluidic 근거한 기술은 단 하나 세포 수준에 유전자 발현의 분석에서 점점 더 빈번하게 이용되고 있습니다. 미세유체 칩 내의 다중화된 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통해 효과적이고 신뢰할 수 있는 고분해능 단일 세포 전사 분석이 가능합니다. 1-5
명48개 유전자의 단세포 전사 프로파일링을 사용한 이전 연구에서 ASC에서 상당한 전사 이질성이 관찰되었습니다. 6 그러나 MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 유전자의 분포는 고도의 골형성 전사 프로파일을 가진 세포 클러스터와 강한 연관성을 나타냈습니다. 이 골형성 유전자 발현 프로파일에 따라 세포를 분리하기 위해 표면 항원 발현 패턴은 전사 패턴과....
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프로토콜
참고 : 모든 환자 샘플 동의 얻었다, 실험 프로토콜을 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 승인되었다.
1. 세포 분리 및 문화 :
- 일반 / 국소 마취하에 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지 영역의 선택 과목 lipoaspiration를 받고 건강한 여성 환자에서 인간의 피하 지방 조직을 얻습니다. 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 인체 조직에서의 ASC를 분리의 프로토콜 얻어되었는지 확인하고, 그러한 물질들로 작업하는 동안 제도적 안전주의 사항을 따르십시오.
- lipoaspirated 지방 조직에서 SVF를 얻으려면, 먼저 1X 멸균 인산 완충 생리 식염수를 같은 부피 (PBS)와 리포 애스 퍼 레이트 세 번 씻는다. 조심스럽게 기음과 바닥 수성 층을 버린다.
- 내가 행크의에서 콜라 0.075 % 유형 : 콜라겐 소화 버퍼를 준비균형 소금 솔루션 (HBSS). FACS 버퍼를 준비 : 2 % FBS, 1 % P188 및 PBS에 1 % 펜 연쇄상 구균을. 시판 0.22 ㎛의 공극 크기 빠른 유동 폴리 필터를 사용하여 두 용액을 필터.
- 세척 된 지방 조직을 소화, 37 ° C (약 180 흔들기 / 분)에서 6....
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결과
인간의 ASC (그림 1A, 1B)의 고농축 인구의 분리 향상된 골 형성의 결과 세포 마커로서 CD90 사용. 태평양의 ASC는 블루 - 공액 항 - 인간 CD45, FITC 접합 된 항 - 인간 CD105 및 APC 공액 항 - 인간 CD90으로 염색 하였다. 정렬 후 분석으로 정량으로 정렬 한 후 순도의 수준은 98 % 이상이었다.
두 개의 새로운 개체군의 미래의 격리를 위해 허용 전사 프로필을 기반으로 세포의 그룹을 정의. 앞서 설명한대로 6,8,9 각 유망 모집단 (낮은 CD90 및 CD105 +)의 전위 골 형성뿐만 아니라, 그 정렬되지 않은 체외에서 인구의 특성을, 세포를 14 일 골 세포 분화 배지에서 배양 하였다. 7 일째에 (골 형성 (10)의 조기 검출을 위해 사용) 알칼리 포스 파타 아제 염색 CD90 + 크게 증.......
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토론
현재, 인간 지방 조직의 SVF에서의 ASC의 동종 개체군의 분리는 바람직한 목표 그래도 도전 남아있다. 이러한 세포는 골격 조직의 형성 및 항상성을 연구하는데 이용 될 수있는 친 조골 ASC의 개체군의 분리는, 특히 바람직하다. 그러나, 지방 조직의 SVF는. 셀 용량과 분화 가능성을 막기위한 관련이 이질성에 대한 분자 기초는 세포의 풀링 된 인구에서 이해 될 수없는 11 이질성을 품고, 대신 단일 세포 분석을 필요로한다. (12)이 방법을, 표면 마커는 밀접의 ASC의 조골 세포 분화 능력이 확인 될 수와 연관된.
상기 방법에 설명 된대로의 ASC 성공적 농축을위한 가장 중요한 요소는, FACS에 이용 된 항체에 관한 것이다. 하나는 CEL에 대한 높은 친 화성 항체를 선택 신중해야문제의 1- 표면 마커. 이상적으로는, 따라서 여러 단계와, 세포 사멸, 세포 손실 및 오류 적립되는 기회를 증가 요구 간접 염색법, 반대로 일차 공액 된.......
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공개 사항
저자 중에이 원고에서 언급 된 제품, 장치 또는 약물의에 재무 적 이해 관계가 없습니다. 저자 중에보고 어떤 경쟁 금융 관심이 없다.
감사의 글
본 연구는 건강 연구 보조금 R01-DE021683-01 및 건강 연구 보조금 R01 - DE019434의 국립 연구소 MTL에 국립 연구소에 의해 지원되었다; MTCDCW 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구 활동은 ACS 프랭클린 마틴 교수 연구 활동, 소아 재생 의학 Hagey 연구소와 스탠포드 대학 아동 건강 연구소 학부 학술 수상에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 일회용 250 ml 원뿔형 튜브 | Corning (Thomas Scientific) | 2602A43 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제 | Gibco | 10566-016 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| Betadine - 항균 Povidone/Iodine 용액 | Purdue | PFC-67618015017 | |
| Hank's Balanced Salt Solution, 1X | Cellgro | 21-023-CV | |
| Fetal Bovine Serum, 인증, US Origin | Gibco | 16000-044 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-5G | |
| ACCUTASE 세포 분리 솔루션 | 줄기 세포 기술 | 7920 | |
| APC 마우스 Anti-Human CD90 | BD Pharmingen | 559869 | |
| FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin) | BD Pharmingen | 561443 | |
| Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue 대체품) | eBioscience | 48-9459-41 | |
| Anti-Human CD34 APC | eBioscience | 17-0349-41 | |
| Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE | eBioscience | 12-0319-41 | |
| Streptavidin PE-Cy7 | eBioscience | 25-4317-82 | |
| BD FACS Aria II 기기 | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software | BD Biosciences |
참고문헌
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298
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