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방법 논문

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

11.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52181

⸱

2015년 1월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

초록

골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC)는 줄기세포 기반 조직 공학 응용 분야의 황금 표준으로 간주됩니다. 그러나 수확해야 하는 과정은 상당한 기증자 부위 이환율과 관련이 있을 수 있습니다. 반면, 지방 유래 기질 세포(ASC)는 더 쉽게 풍부하고 더 쉽게 채취할 수 있어 BM-MSC에 대한 매력적인 대안이 됩니다. BM-MSC와 마찬가지로 ASC는 골형성 계통 세포로 분화할 수 있으며 두개안면 골격 결손에 사용하기 위해 골격에 파종하는 것과 같은 조직 공학 응용 분야에 사용할 수 있습니다. ASC는 ASC, 혈관 내피 세포 및 벽화 세포, 평활근 세포, 주위 세포, 섬유아세포 및 순환 세포의 이질적인 혼합물인 소화된 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)에서 얻습니다. 유세포 분석은 ASC에 대한 표면 마커 프로파일이 BM-MSC에 대한 표면 마커 프로파일과 유사하다는 것을 보여주었습니다. ASC 표현형에 대한 마커를 확립하는 여러 발표된 보고서에도 불구하고 이 이질적인 집단에서 골전구 세포를 식별하는 프로필에 대한 합의가 여전히 부족합니다. 이 프로토콜은 중요한 크기의 calvarial defects를 복구하기 위해 향상된 osteogenic capacity를 가진 ASC의 하위 모집단을 분리하고 사용하는 방법을 설명합니다.

서론

줄기세포 집단의 이질적인 특성은 아직 완전히 이해되지 않았으며 임상적으로 효과적인 줄기세포 기반 치료 응용 프로그램의 개발에 주요 장애물로 남아 있습니다. 이질적인 줄기세포 집단을 특성화하는 가장 일반적인 방법 중 하나는 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 같은 세포 분류 방법을 사용하여 표면 마커 발현 프로파일을 기반으로 세포를 분리하는 것입니다. 분류 방법이 더욱 복잡해짐에 따라 세포의 보다 뚜렷한 기능적 하위 집단을 식별하는 것이 가능해집니다. Microfluidic 근거한 기술은 단 하나 세포 수준에 유전자 발현의 분석에서 점점 더 빈번하게 이용되고 있습니다. 미세유체 칩 내의 다중화된 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 통해 효과적이고 신뢰할 수 있는 고분해능 단일 세포 전사 분석이 가능합니다. 1-5

명

48개 유전자의 단세포 전사 프로파일링을 사용한 이전 연구에서 ASC에서 상당한 전사 이질성이 관찰되었습니다. 6 그러나 MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 유전자의 분포는 고도의 골형성 전사 프로파일을 가진 세포 클러스터와 강한 연관성을 나타냈습니다. 이 골형성 유전자 발현 프로파일에 따라 세포를 분리하기 위해 표면 항원 발현 패턴은 전사 패턴과 상관관계가 있었고 엔도글린(CD105)의 표면 마커 발현은 ASC의 향상된 골생성 분화 잠재력과 밀접한 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌습니다. CD105 발현과는 별개로, Chen 등이 이전에 골전구세포와 관련이 있는 것으로 밝혀진 글리코실-포스파티딜이노시톨 결합 막 단백질인 표면 수용체 Thy-1(CD90)의 발현도 골형성 유전자 발현과 상관관계가 있었습니다. 6,7 이러한 발견은 세포 기반 뼈 조직 공학 응용 분야를 위한 골형성 능력이 증가된 ASC의 더 큰 이질적인 풀 내에서 하위 집단을 전향적으로 분리할 수 있는 기회를 제공합니다.

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프로토콜

참고 : 모든 환자 샘플 동의 얻었다, 실험 프로토콜을 검토하고 스탠포드 대학의 임상 시험 심사위원회 (프로토콜 # 2188과 # 9999)에 의해 승인되었다.

1. 세포 분리 및 문화 :

  1. 일반 / 국소 마취하에 복부, 옆구리, 및 / 또는 허벅지 영역의 선택 과목 lipoaspiration를 받고 건강한 여성 환자에서 인간의 피하 지방 조직을 얻습니다. 임상 시험 심사위원회 (IRB) 승인 인체 조직에서의 ASC를 분리의 프로토콜 얻어되었는지 확인하고, 그러한 물질들로 작업하는 동안 제도적 안전주의 사항을 따르십시오.
  2. lipoaspirated 지방 조직에서 SVF를 얻으려면, 먼저 1X 멸균 인산 완충 생리 식염수를 같은 부피 (PBS)와 리포 애스 퍼 레이트 세 번 씻는다. 조심스럽게 기음과 바닥 수성 층을 버린다.
  3. 내가 행크의에서 콜라 0.075 % 유형 : 콜라겐 소화 버퍼를 준비균형 소금 솔루션 (HBSS). FACS 버퍼를 준비 : 2 % FBS, 1 % P188 및 PBS에 1 % 펜 연쇄상 구균을. 시판 0.22 ㎛의 공극 크기 빠른 유동 폴리 필터를 사용하여 두 용액을 필터.
  4. 세척 된 지방 조직을 소화, 37 ° C (약 180 흔들기 / 분)에서 60 분 동안 진탕 수욕 안전하게 분해 용기를 콜라게나 제 소화 버퍼의 동일 부피를 추가 배치.
    참고 :이 떨고 동안 최대한의 소화 수 있습니다대로, 요구되는 것보다 더 큰 볼륨 분해 용기를 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다 (즉, 콜라겐 소화 버퍼 250 ml의, 1L 멸균 플라스크에 씻어 지방 조직의 250 ㎖).
  5. FACS 완충액의 동량을 첨가하고 5 분 동안 RT에 앉아 있도록함으로써 효소 활성을 중화. 다음, 4 ℃에서 20 분 동안 233 XG에 원심 분리기.
  6. 조심스럽게 기음과 고밀도 SVF 펠렛을 방해하지 돌보는, 상층 액을 제거한다.
  7. RT 레드 5-10 ml의 펠렛을 재현 탁세포 펠렛의 크기에 기초하여, 용해 완충액. 실온에서 5 분 동안 233 XG에서 5 분 원심 분리기에 대한 RT에 앉아 솔루션을 남겨주세요.
  8. 기음 상등액과 펠릿 크기에 따라 기존의 성장 배지 5-10 ml를 첨가하여 펠릿을 재현 탁 (둘 베코 변형 이글 중간 [DMEM] / 10 % FBS / 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 [펜 연쇄상]).
  9. 세포 파편을 제거하기 위해 100 ㎛ 나일론 세포 여과기를 통해 현탁액을 여과.
  10. 4 ° C에서 5 분 233 XG에 원심 분리기 및 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다.
  11. 펠릿의 크기에 기초하여 기존의 성장 배지 5~10 ㎖,에 펠렛을 재현 탁.
  12. 15cm 표준 배양 접시에 2 × 10 6 세포를 놓고 37 ° C / 21 % O 2, 5 % CO 2에서 차 문화 O / N을 설정합니다. 37 ° C / 21 % O 2, 성장 배지에서 5 % CO 2에서 자발적인 분화를 방지하기 위해 서브 합류 수준에서 유지한다.
    참고 : 완전히의 셀 밀도합류 15cm 플레이트는 약 4-6 × 106 세포이다.

2. 염색

  1. 염색하기 전에 36 시간 동안 37 ° C / 21 % O 2, 5 % CO 2, 전통적인 성장 배지에서 배양의 ASC는 / 정렬.
  2. (제조사의 프로토콜에 따라) Accutase를 사용하여 배양 접시에서 리프트의 ASC.
  3. 한 번 (2 % FBS와 1 % 펜 연쇄상 구균과 PBS) FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오.
  4. 4 ℃에서 5 분 동안 233 XG에 원심 분리기.
  5. 펠렛을 방해하지 않고 상층 액을 버린다. FACS 완충액 0.5 ml의 세포를 재현 탁 (세포 수 및 항체의 원하는 양에 따라).
    주 : 세포 현탁액의 부피는, FACS 항체 제조자의 권고에 따라, 항체 농도를 결정한다. 그러나, 항체의 농도가 적정, 하나의 출발 농도를 사용 : 그것은 항체를 사용하는 최초 시간 인 경우 (100), 일반적으로 권장된다.
  6. 총 수를 계산혈구를 사용하여 세포.
  7. 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에서 예약 100 UL 분취 흠 샘플 (사용하는 형광 항체의 수에 따라) 단일 색상 조절을 위해 사용된다.
  8. (제조업체의 지침에 따라 소정의 농도에서) 적절한 형광 표지 된 단일 클론 항체를 추가하고 빛으로부터 보호 얼음에 20 ~ 30 분 동안 품어.
    1. 골 형성 모집단 레이블을 지정하려면 : 1시 50분의 농도로 FACS 버퍼에 안티 CD90 (APC 안티 - 인간 CD90 (Thy1)) 또는 안티 CD105 (FITC 안티 - 인간의 CD105 (endoglin))를 희석.
    2. 다른 세포 집단 (예를 들어, 조혈 및 내피 세포)에 레이블을 지정하려면 : 안티 CD45 (안티 - 인간 CD45 태평양 블루), 항 CD34 (안티 - 인간 CD34 APC), 및 / 또는 항 CD31 (안티 - 인간 CD31 PE를 희석 ) FACS 1:50의 농도로 버퍼.
    3. 직접 접합 된 항체를 사용하지 않는 경우, 적절한 스트렙 타비 딘 - 접합 제와 비오틴 차 항체를 사용하여하나의 희석 등 스트렙 타비 딘 PE-Cy7로 진 항체, 100.
  9. 상층 액을 흡입, 4 ° C에서 5 분 동안 233 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기와 튜브를 채우기 : 부화 후, 두 번 세포를 씻으십시오.
  10. 세포 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 400 ~ 500 μL FACS 버퍼 및 필터 샘플에서 세포를 재현 탁.
  11. 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 세포를 전송하고 분석 기간 동안 얼음에 샘플을 유지.

3. 형광 활성화 셀 정렬

주 : 다음 단계는 이전 형광 활성화 된 세포에서 지식 정렬 (FACS) 또는 숙련 된 기술자의 도움을 의무화.

  1. 포워드 산란 (FSC), 측면 산란 (SSC)를 조사하기 위해 설계 분석 플롯을 적절한 FACS 소프트웨어를 이용하여, 피코 에리 트린 (PE) - 텍사스 레드, 퍼시픽 블루, 형광 염료 (FITC), 알로 피코시 아닌 (APC)와 다른 형광 물질을 사용D는 세포 레이블을.
  2. 셀 소터, 잠시 소용돌이 세포를 재현 탁 각 샘플에로드하기 전에.
  3. 세포 파편을 제외하고,베이스 라인 형광도를 결정하기 위해, 전체 세포 집단을위한 게이트를 설정하기 위해 흠 견본의 분석을 시작.
  4. 흠 견본에 요오드화 프로피 듐 (PI)를 첨가하고, 전체 세포 집단 내에서 살아있는 세포 집단을 시각화하기 위해 그것을 분석. 이 인구 주위에 게이트를 구축합니다.
  5. 형광 보정을 설정하기 위해 각각의 형광 색소에 대한 단색 대조군 샘플을 분석한다.
  6. 정렬 게이트의 위치를​​ 설정하는 스테인드 샘플을 분석 할 수 있습니다.
  7. 죽은 세포를 염색하기 위해 염색 된 샘플에 PI를 추가합니다.
  8. 표지 된 세포 집단을 정렬합니다. 정렬 1.5 ml를 원심 분리기 튜브 또는 배양 배지를 함유하는 원뿔형 튜브 (15 mL) 중 하나에.
  9. 수동 셀들의 수량이 필요한 구하면 정렬 중단.
  10. 우리FACS를 보내고, 극히 일부를 분석 (예., 500 세포) 취득 된 세포 집단의 순도에 의해 검사를 수행한다.
    참고 :이 단계는 정렬 된 세포 집단의 순도를 확인합니다. 이상적으로, 순도 90-95 % 이상이어야한다.
  11. 39 °에서 5 분 동안 원심 분리기 (233) XG 세포를 즉시 10 % FBS를 함유하는 새로운 배지 1 ㎖에 정렬 완료하고 다음을 재현 탁시켰다.
    주 : 사용 된 용지의 양이 세포 펠렛의 크기에 따라 증가 될 수있다.
  12. 젤라틴 코팅 플레이트에 플레이트는 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 최종 세포 수율, 판 6 웰 플레이트에 웰 당 30 만 셀, 12 웰 플레이트에 웰 당 10 만 셀에 따라.

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결과

인간의 ASC (그림 1A, 1B)의 고농축 인구의 분리 향상된 골 형성의 결과 세포 마커로서 CD90 사용. 태평양의 ASC는 블루 - 공액 항 - 인간 CD45, FITC 접합 된 항 - 인간 CD105 및 APC 공액 항 - 인간 CD90으로 염색 하였다. 정렬 후 분석으로 정량으로 정렬 한 후 순도의 수준은 98 % 이상이었다.

두 개의 새로운 개체군의 미래의 격리를 위해 허용 전사 프로필을 기반으로 세포의 그룹을 정의. 앞서 설명한대로 6,8,9 각 유망 모집단 (낮은 CD90 및 CD105 +)의 전위 골 형성뿐만 아니라, 그 정렬되지 않은 체외에서 인구의 특성을, 세포를 14 일 골 세포 분화 배지에서 배양 하였다. 7 일째에 (골 형성 (10)의 조기 검출을 위해 사용) 알칼리 포스 파타 아제 염색 CD90 + 크게 증...

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토론

현재, 인간 지방 조직의 SVF에서의 ASC의 동종 개체군의 분리는 바람직한 목표 그래도 도전 남아있다. 이러한 세포는 골격 조직의 형성 및 항상성을 연구하는데 이용 될 수있는 친 조골 ASC의 개체군의 분리는, 특히 바람직하다. 그러나, 지방 조직의 SVF는. 셀 용량과 분화 가능성을 막기위한 관련이 이질성에 대한 분자 기초는 세포의 풀링 된 인구에서 이해 될 수없는 11 이질성을 품고, 대신 단일 세포 분석을 필요로한다. (12)이 방법을, 표면 마커는 밀접의 ASC의 조골 세포 분화 능력이 확인 될 수와 연관된.

상기 방법에 설명 된대로의 ASC 성공적 농축을위한 가장 중요한 요소는, FACS에 이용 된 항체에 관한 것이다. 하나는 CEL에 대한 높은 친 화성 항체를 선택 신중해야문제의 1- 표면 마커. 이상적으로는, 따라서 여러 단계와, 세포 사멸, 세포 손실 및 오류 적립되는 기회를 증가 요구 간접 염색법, 반대로 일차 공액 된...

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공개 사항

저자 중에이 원고에서 언급 된 제품, 장치 또는 약물의에 재무 적 이해 관계가 없습니다. 저자 중에보고 어떤 경쟁 금융 관심이 없다.

감사의 글

본 연구는 건강 연구 보조금 R01-DE021683-01 및 건강 연구 보조금 R01 - DE019434의 국립 연구소 MTL에 국립 연구소에 의해 지원되었다; MTCDCW 하워드 휴즈 의학 연구소의 연구 활동은 ACS 프랭클린 마틴 교수 연구 활동, 소아 재생 의학 Hagey 연구소와 스탠포드 대학 아동 건강 연구소 학부 학술 수상에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
일회용 250 ml 원뿔형 튜브Corning (Thomas Scientific)2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)Gibco15140-122
DMEM, 고포도당, GlutaMAX 보충제Gibco10566-016
PBS, pH 7.4Gibco10010-023
Betadine - 항균 Povidone/Iodine 용액Purdue PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1XCellgro21-023-CV
Fetal Bovine Serum, 인증, US OriginGibco16000-044
Collagenase from  Clostridium histolyticumSigma-AldrichC0130-5G
ACCUTASE 세포 분리 솔루션줄기 세포 기술7920
APC 마우스 Anti-Human CD90BD Pharmingen559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)BD Pharmingen561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue 대체품) eBioscience48-9459-41
Anti-Human CD34 APCeBioscience17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PEeBioscience12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7eBioscience25-4317-82
BD FACS Aria II 기기BD Biosciences
BD FACSDiva SoftwareBD Biosciences

참고문헌

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  20. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).

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