방법 논문

암 약물 과민 반응의 효과를 평가

DOI:

10.3791/52388

⸱

2015년 2월 6일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Microbiology and Immunology, Western University, 2Biochemistry, Western University, 3Surgery, Western University, 4Oncology, Western University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 전이의 in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane(CAM) 모델과 결합된 종양 세포 대사의 실시간 모니터링을 사용하여 종양 세포를 DNA를 손상시키는 화학 요법에 감작하는 능력에 대해 새로운 항암 표적/제제를 평가하는 데 사용됩니다.

초록

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이질성 때문에 동일한 경로를 대상으로 인간의 암 치료 단독 투여 또는 조합 요법에 내재 돌연변이 하이 레벨로, 실패 할 가능성이있다. 중점 치료에 고유 및 / 또는 적응 저항에 대한 책임이 있습니다 경로의 억제에 배치해야합니다. 조사의 활성 필드는 일반적으로 개발 및 화학 요법과 방사선 요법을 사용의 작용을 촉진하고, 내성을 방지 DNA 수리 억제제의 시험이다. 우리는 DNA 손상 약물 시스플라틴에 종양 세포를 감작하는 수단으로 BRCA2 억제의 효과를 평가하기 위해 신규 한 프로토콜을 사용했다. 종양 세포 대사 (호흡 산성화)는 분 단위로 분에 치료 효과를 묘사하기 위해 72 시간 동안 실시간으로 모니터링 하였다. 조합에서, 우리는 닭 배아 융모 막 (CAM) 혈관 외 유출과 침략의 모델을 이용하여 전이 주파수의 평가를 수행 하였다. 이프로토콜은 새로운 암 치료 요법을 평가하기 위해 생체 외 및 생체 방법에 사용되는 일반적으로의 약점 중 일부를 해결합니다. 이는 이러한 세포 증식 분석, 세포 사멸 분석과 같은 일반적인 방법에 더하여 사용될 수 있으며, 생체 내 뮤린 이종 이식 연구에서 더욱 밀접 후보 타겟 및 에이전트들 사이를 구별하고, 또한 개발을위한 가장 유망한 후보를 선택한다.

서론

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세포 독성 암 치료는 치료 실패, 재발로 이어질 수있는 중요한 임상 적 문제가 대상 및 / 또는에 대한 내성을 획득하고, 환자 사망률 1 증가했다. 대부분의 종양에서 이질성의 높은 수준을 고려할 때, 충분히 높은 세포 수의 종양은 그 세포가 생존 2,3- 대해 의존하는 분자 경로를 표적으로 단일 또는 조합 요법에 내성 세포의 서브 세트를 포함 할 것이다 수학적 확실성이다. 종양 세포에 긍정적 재발 선도, 치료 기간 동안 선택 될 수있다. 동시에 전 또는 치료 매개 선택 이후에, 다른 암 세포 생존 메카니즘을 대상 신규 치료법의 개발은, 따라서 임상 적으로 중요한 것이다.

종양에서 게놈의 불안정성 게놈 돌연변이의 높은 수준의 비 종양 (4) 숙주 세포로부터 암세포를 구별 기본적인 특징이다. 따라서, usefu- DNA 손상 화학 요법의 효능을 증가시키는 저항의 발생을 예방하기 위해 L 전략 적극적 종양 세포 5 DNA 복구를 억제하는 것이다. 이것은 예비 임상 탐구되고 조사 및 신규 DNA 복구 다양한 대상의 활성 필드이다. 이들 소분자 또는 안티센스 표적 계 억제제의 수는 개발되어 6-8 테스트 겪고있다. 목적은 임상 시험에서 안전성과 효능을 가장 유망한 전임상 후보를 식별하고 평가하는 것입니다.

임상 시험의 고비용 (차선 전임상 평가를 포함한 여러 이유로) 실패의 위험이 새로운 치료법의 개발에 9 진행 강력한 장애물이다. 적절히 치료 대상 및 새로운 약물 후보를 평가할 수있는 적절하고 엄격한 전임상 모델의 사용은 임상 시험 (10)의 높은 실패율을 감소시킬 수있다 .

시험 관내 (세포 증식 분석법) 종양 세포의 능력에있어서, b) 치료 - 유도 환원에서 종양 세포의 증식을 감소시키는 능력) 측정 : 일부 공통적으로 사용 전임상 방법은 신규 한 항암 요법의 효과이다을 평가 폼 조직 배양 콜로니 (콜로니 형성 어 세이) 시험 관내 (레 독스 염료 변환) 시험 관내 종양 세포 사멸, d) 요법 - 유도 유도 (세포 사멸, 괴사가 포식이 연관된 종양 세포 대사 활동에있어서, c) 요법 - 유도 환원 생체 내에서 유사 분열 등) (11), 전자)와 함께 인간과 마우스 이종 이식 12-14의 성장 또는 절제의 감소를 치료 유도.

체외 나열된 방법 중 가장 큰 문제점은 이들 중 어느 것도 후보 치료제의 효과를 실시간 평가를 제공하지 않는다는 것이다. 오히려, 그들은 단지 선택된 넓게 분리 된 시점에서 정보를 제공 할치료 과정 동안. 이러한 측정은 정확하게 종양 세포 반응의 강도 및 타이밍을 반영하는 능력을 감소 하였다. 생체 내 마우스 이종 이식 모델은 또한 높은 비용, 완료하는 시간의 길이, 차선 투여 및 치료시기 (스케줄링)의 위험에 의해 제한된다. 또한, 설치류 이종 이식 모델 차 인간 종양 세포의 반응을 시험 관내 평가와 비교하여 인간에서의 임상 효능 한정 예측 및 후보 치료 개입 (15, 16)에 확립 된 인간 종양 세포주가 있다는 증거가있다.

우리는 위에서 설명한보다 일반적인 절차의 단점을 해결하는 방식으로, 예비 임상 신약 조합을 평가하기 위하여 새로운 조합 프로토콜을 고안했다. 증식, 콜로니 형성 또는 산화 환원 염료 변환 분석 대신에, 우리는 실시간으로 세포 부착, 호흡, 산성화를 분석 대사 측정 유닛을 이용전체 치료 기간 동안 17. 동시에, 우리는 닭 배아 침윤 및 전이의 융모 18,19 막 (CAM) 모델을 사용하여 생체 내에서 조합 치료의 효과를 조사 하였다. 우리는 일반적으로 사용되는 화학 요법 약물 시스플라틴의 효과를 강화시키는 데 BRCA2 타겟팅 안티센스 올리고 뉴클레오티드 (ASO)의 능력을 평가하기 위해 다음 방법을 사용 하였다.

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프로토콜

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참고 : 다음 프로토콜이 부착 세포와 함께 사용하도록 설계되었습니다. 수정은 정지에서 재배 비 부착 세포에 방법을 적용해야합니다. 프로토콜에 설명 된 CAM 실험은 형광 표지 (예를 들면, GFP, RFP 등)를 발현하는 세포와 함께 사용하도록 설계된다. 나인 일된 닭 배아 CAM 실험에 대한 실험 프로토콜의 2 일에 필요합니다.

1. 준비 및 안티센스 올리고 뉴클레오티드와 종양 세포의 형질 (ASOS)

  1. 관심의 세포를 포함하는 T75 플라스크 (들)에서 대기음 매체는 1XPBS로 세척하고, 0.25 % 트립신 / EDTA 2 ㎖를 추가합니다. 각 플라스크에 완전 성장 배지 10 ㎖를 첨가하고 50 ㎖ 튜브 용액에 세포를 옮긴다. 세포를 세어 최종 농도는 1 ㎖ 당 1.0 × 105 세포가되도록 양을 조정한다.
  2. T25 플라스크의 라벨 두 그룹 : 한 그룹은 1-8 표시 여덟 플라스크를 포함하며, U 될 것입니다실시간 대사 측정 실험 SED; 두 번째 그룹은 8 주 형틀을 포함하고 닭 배아 CAM 실험에 사용한다. 인큐베이터에있는 각 플라스크 및 장소 (37 ° C, 5 % CO 2 O / N)에 솔루션 세포 2 ㎖를 추가합니다.
  3. 다음날 아침 (주 0, 0 분), 라벨 세 5 ml의 튜브를 다음과 같이 제어 (비 대상 ASO 또는 siRNA를), '관심의 대상'(즉, 대상 ASO 또는 siRNA를), 리포 펙 타민 2000 (또는 유사한 형질 전환 시약). 적합한 튜브에서 무 혈청 배지로 적당한 농도 ASO 스톡 용액을 희석.
    1. 적절한 튜브에 형질 전환 시약의 요구량을 첨가하고, 5 분 동안 무 혈청 배지에서 배양한다. ASO 튜브에 형질 전환 시약 솔루션을 추가하고 20 분 동안 품어.
  4. 각 그룹에서 플라스크 1-4의 각 제어 ASO 형질 전환 시약 용액 250 μl를 추가, 250각각의 그룹 내의 5-8 플라스크 각각에 '관심 대상'ASO 형질 감염 시약 용액 μL. 4 시간 (37 ᵒC, 5 % CO 2)에 대해 품어.
    1. 배양하는 동안, 2.1 절에 설명 된 단계를 수행한다. 배양 후, CAM 실험 그룹의 각 플라스크에 완전 배지 3 ㎖을 추가하고 인큐베이터로 복귀 O / N (37 ᵒC, 5 % CO 2). 2.2 절에 설명에 따라 대사 실험 그룹을 처리합니다. 섹션 4의 설명에 따라 설정 CAM 실험을 처리합니다.

2. 바이오 센서 칩 준비 및 셀 시드

  1. 무균 환경에서 조심스럽게 PBS 400 ㎕의 여섯 바이오 센서 칩을 씻는다. 20 분 동안 70 % 에탄올 400 μL와 칩 멸균. PBS의 400 μL로 3 회 세척 할 것.
    1. 무균 조직이 배양 내부의 칩을 배치전자 요리 오염을 방지합니다. '제어'라고 표시된 접시에 세 개의 칩을 놓고 '관심의 대상'이라는 레이블이 붙은 접시에 세.
  2. '제어'와 '관심의 대상'으로 두 개의 50 ㎖ 튜브 레이블. PBS로 세포를 씻으 0.25 % 트립신 / EDTA의 적절한 볼륨을 추가합니다. 단일 층 분리 될 때까지 기다린 후 각 플라스크에서 세포를 수집합니다. 적절한 튜브에 용액을 증착.
    1. 세포를 세어 6.0x10 최종 농도가 105 세포 / ㎖가되도록 양을 조정한다. 초기 농도가 너무 낮 으면 원심 분리하고 세포를 재현 탁.
  3. (칩당 1.25x10 5 세포의 총) 해당 그룹의 각 바이오 센서 칩에 셀 용액 250 μL를 추가한다. 칩 혼란의 위험을 최소화하기 위해 한 번에 하나의 그룹이 태스크를 수행한다. 증발을 방지하기 위하여 습도 챔버 내부의 칩을 함유하는 멸균 접시를 놓은 습도 차를 배치mber 인큐베이터에서 O / N (37 ᵒC, 5 % CO 2).
  4. 이튿날 아침 (주 1)은, 각 칩으로부터 신중 매체 대기음 0.2 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1X 페니실린 및 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 성장 배지 250 μL로 대체. 4 시간 (37 ᵒC, 5 % CO 2)에 대해 품어.

3. 대사 측정 시스템 준비 및 솔루션 준비

  1. 배양 중에 필요한 약액과 다가오는 대사 분석 용 측정 시스템을 준비한다.
    참고 : 대사 측정 시스템은 여섯 모듈의 총이 포함되어 있습니다. 각 모듈은 실험 당 하나의 칩을 수용한다.
    1. 다음 실험 그룹으로 분석 세분 : 하나의 칩을 '제어'와 분석의 기간 동안 차량을받을 수있는 그룹 '관심의 대상'에서 각각; 각 그룹은 두 개의 칩 중 소정의 기간에 대한 약물 치료를받을ssay, 세척 기간 동안 차량 하였다.
    2. 감작 약물 연구의 경우, 해당 특정 약물에 맞는 약물 치료의 길이, 타이밍 및 농도를 변경.
      주 : 시스플라틴의 경우, 다음 단계는 A549 세포와 경험적으로 결정하고, 세포주에 따라 달라질 수있다. 4 μL / 분의 기본 유량을 갖는 모든 단계를 수행한다.
      성장 배지 + 0.2 % FBS, 1X 및 P / S 6 HR
      매체에서 6 μM 시스플라틴의 24 시간 + 0.2 % FBS 1 배 P / S
      성장 배지 + 0.2 % FBS, 1X 및 P / S에 24 시간
      성장 배지 + 0.2 % FBS, 1X 및 P / S (18)의 HR
      0.1 % 트리톤 X의 4 시간
      참고 :이 단계로부터의 편차 원하는 유량과 실험의 지속 기간에 기초하여 중간 및 약물 용액의 필요한 양을 결정하기 위해 계산을 필요로 할 것이다. 다음 섹션은 위에서 설명 된 단계를 기준으로합니다.
  2. 라벨 및 성장 배지 + 0.2 % FBS를 50 ml의 열네 50 ㎖ 튜브를 채우기D 1 배 P / S. 한 대사 측정 시스템 튜브 랙에 여섯, 다른 여섯, 또한 시스플라틴과 튜브가 들어 세 번째 튜브 랙의 나머지 두 놓습니다. 증발을 방지하기 위하여 공기 투과성 막을 처음 두 실 랙.
  3. 1 배 P / S 중간 + 0.2 % FBS에서 (해당 볼륨의) 6 μM 시스플라틴의 솔루션을 준비합니다. 네 표지 50 ㎖ 튜브에 시스플라틴 용액의 필요한 양을 분배.
    1. 세 번째 대사 측정 튜브 랙에 남아있는 4 개의 슬롯에 튜브를 놓습니다. 튜브가 원하는 biomodules에 해당하는 해당 슬롯에 배치되어 있는지 확인합니다. 공기 투과 막으로 튜브를 밀봉합니다.
  4. 준비하고 여섯 50 ㎖ 튜브에 라벨을 20 ml의 배지에서 0.1 % 트리톤-X 솔루션의 각각을 입력합니다. 트리톤-X 솔루션은 남아있는 세포를 용해하고 각각의 칩에 대한 '제로'가치를 제공 할 것입니다. 네 번째 대사 측정 단위 튜브 랙에 튜브를 삽입하고 재치 밀봉H 과도한 증발을 방지하기 위해 공기 permable 막.
  5. biomodules에 칩을 넣고 실험을 시작합니다.

4. CAM 실험 약물 치료와 주사

참고 : CAM 실험을위한 닭 배아를 준비하는 단계와 절차는 다른 19 설명되어 있습니다

  1. CAM 실험 48 시간 후 - 형질 전환 (2 일)을 처리하기 시작합니다. 두 차량 플라스크 및 시스플라틴 두에 '제어'와 그룹 '관심의 대상'을 하위 나눕니다. 플라스크에서 매체를 대기음 3 신선한 매체의 ml의, 또는 6 μM 시스플라틴 (cisplatin) 중 하나와 함께 보충. 6 시간 (37 ᵒC, 5 % CO 2)에 대해 품어.
  2. 세척 한 후, 매체를 대기음 세포를를 Trypsinize; 네 적절하게 레이블 15 ml의 튜브에 용액에 트립신 세포를 수집합니다.
    1. 원심 분리기와 PBS로 세포를 세 번 씻는다. PBS 5ml에 세포 펠렛을 다시 일시세포를 카운트 좋아.
    2. 최종 세포 농도가 1.0 × 6 세포 / ml가되도록 양을 조정한다. 주입 표지 5 ml의 튜브에 세포 솔루션을 전송하고 얼음에 배치합니다. 세포가 잘 혼합되도록 조심스럽게 주입 전에 튜브를 전환.
  3. 주사 (9 일 이전) (24) 닭의 배아 (그룹 당 6)의 총을 옆으로 설정합니다. 1 ml의 시린지에 연결된가요 성 튜브에 부착 된 유리를 사용하여 바늘 주사를 수행한다. 주입을 수행하는 개별 처리 그룹 멀게한다.
    1. 스테레오 현미경을 이용하여, CAM의 정맥 순환에 1.0 × 100 μL 부피의 5 세포를 주입. 세포의 전체 볼륨을 주입하는 속도가 느린, 맥동 기술을 사용합니다. 부드러운 혈액의 흐름을 줄기 및 유출을 흡수 닦아 부드럽게 주사 부위를 가볍게 두 드리십시오. 적절하게 각 주입 다음 각 배아 컨테이너 레이블.
  4. 존재와 DISTRI 확인CAM의 혈관 세포의 형광 bution는 형광 현미경을 사용하여 가시화하여 주 사후. 종양 세포의 수가 적을 나타나거나 유통이 좋지있는 모든 배아에주의하십시오.
  5. 습도 챔버에서 닭 배아를 놓고 인큐베이터 (37 ° C, 습도 60 %)에 저장합니다. 전이성 초점을 열거하기 전에 7~9일 기다립니다.

5. 전이성 초점 열거

  1. 7~9일 배양 기간 동안 배아를 모니터링하고 죽은 사람을 버린다. 습도 챔버는 배양 기간 동안 항상 습기가 남아 있는지 확인합니다.
  2. 20X 배율 스테레오 형광 현미경을 이용하여, 정규, 격자 형상의 패턴으로 배아 CAM의 전체 상부 표면을 스캔.
  3. 다음 배아 당 최종 총 수를 집계, 뷰의 각 필드에 전이 병소의 수를 계산합니다. 각 그룹의 여섯 배아 이렇게하면 평균 O를 제공 할 것입니다치료 당 F 전이성 초점.

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결과

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결과 및 수치는 출판 일 (22)의 허가 적응.

BRCA2 억제 시스플라틴 처리 된 종양 세포 호흡의 감소를 유도

ASO를 BRCA2가 타겟팅 및 시스플라틴 단독 제어 ASO 시스플라틴을받은 세포에 비해 호흡에서 이른 감소 및 비가역을 나타내 처리 인간 A549 폐암 세포; 처리 된 세포를 시스플라틴 치료 24 시간 BRCA2 ASO 제어 ASO 호흡 사이의 차이 후 39 % (도 1a)이었다. 중요한 것은, 호흡 감소는이 세포 수의 변화와 무관 발생한 것을 시사 세포 부착에서 검출 드롭 전에 시작했다. 호흡은 호흡 저하는 세포 사멸 (그림 1B)를 앞에 조형 이벤트가 될 수 있음을 시사 접착의 첫 번째 관찰 드롭이 약 10 시간을 감소하기 시작했다. 교류에 차이 없음idification은 BRCA2 ASO와 시스플라틴 치료가 당...

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토론

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때문에 임상 시험과 관련된 고유의 비용과 위험에, 더 적절하게 신규 항암 치료법을 평가하기위한 예비 임상 시험 방법론보다 엄격한 개발이 요구된다. 현재 일반적으로 사용되는 기술 덜 효과​​적 일 수있다 모든 전시 잠재적으로 유망한 치료 대상 / 에이전트를 구별하는 능력을 제한 할 수 있습니다 약점, 그리고 그. 우리는 기존 방식의 많은 단점을 해결 새로운 항암 접근법을 평가하는 프로토콜을 고안했다.

설명 프로토콜의 특히 중요한 기능은 실시간으로 세포 반응을 측정하고, 분에 의해 신진 대사와 고수 분의 변화를 추적 할 수있는 기능입니다. 이것은 피크 약물 효과, 최적 투여 식별 및 조합 약물 치료의 구성 요소들 사이의 상호 작용의보다 상세한 이해를 위해 허용한다. 동시에, 그것은 discre에 대한 통찰력을 제공합니다셀 카운팅, 아폽토시스, 또는 염료 변환 분석법에 의해 제공되지 않은 정보는 암세포, 테 대사 변화. 이 분석의 한계를 정확하게 약물 치료 중에 발생되는 세포사의 ...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 우수 온타리오 센터와 온타리오 연구 기금 JK 보조금에 의해 가능하게되었다.

우리는 촬영하는 동안 기술 지원을 Siddika Pardhan 박사 피터 퍼거슨 감독에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
A549 세포ATCCCCL-185http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx
AeraSeal filmCarl Roth GmbH
AMEMWisent Bioproducts210-011-QK
Antisense oligodeoxynucleotidesAveciaBRCA2 타겟 서열: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bases 7241-7259 )
Axio Zoom V16 현미경Carl Zeisshttp://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html
Bionas Biosensor ChipsBionas GmbH 및 Micronas GmbHBIS8001D
Bionas Discovery 2500 System Bionas GmbHhttp://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/
CisplatinSigma Aldrich479306
조달한수정된 닭 달걀
태아 소 혈청 Gibco - Life Technologies
리포펙타민 2000 Invitrogen - 라이프 테크놀로지스 12566014
http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html PBSWisent Bioproducts311-010-CL
트립신(0.25%)/EDTAWisent Bioproducts325-043-CL
현지에서

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  20. Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor. Cell Metab. 14, 545-554 (2011).
  21. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).
  22. Rytelewski, M., et al. BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis. Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).

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