방법 논문

장간막 림프 덕트 유관 쥐 모델 : 창자 림프 약물 운송의 평가에 응용

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DOI:

10.3791/52389

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2015년 3월 6일

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1Drug Delivery, Disposition, and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University (Parkville Campus)

이 논문에서

요약

여기에서는 쥐의 장간막 림프관을 캐뉼로화하는 기술을 설명하며, 이를 통해 장 전달 후 림프계를 통한 지질 및 약물 수송을 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 장간막 림프 농도 및/또는 유체, 면역 세포, 펩타이드, 단백질 및 친유성 분자의 수송을 평가하는 데 적용할 수 있습니다.

초록

장 림프 시스템은 유체 수송, 지질의 흡수와 면역 기능에 중요한 역할을한다. 림프 장간막 림프절 덕트 수렴 림프관 및 일련의 노드를 통해 소장에서 직접 흐른다. 장간막 림프절 덕트의 캐 뉼러 따라서 소장에서 흐르는 장간막 림프절의 수집을 할 수 있습니다. 장간막 림프 및 지단백 분획 (지질, 친 유성 분자와 아포 단백질) (사이토 카인과 장 호르몬 등의 유체, 펩타이드 및 단백질) 면역 세포 (99 % 림프구), 수성 부분의 세포 부분으로 구성되어 있습니다. 장간막 림프절 덕트 삽관 모델 따라서 림프계를 통해 농도 및 소장에서 다양한 요인의 이송 속도를 측정하는데 사용될 수있다. 다른 도전에 대한 응답에서 이러한 요소의 변경 (예를 들면, 다이어트, 항원, 약물)과 질병 (예를 들어, 염증성 장 질환, HIV는 당뇨병)도 수 b전자는 결정. 관심을 확대 영역은 장 지질 흡수 경로와 연관 경구 투여 친 유성 약물과 전구 약물의 흡수에 림프 수송의 역할이다. 여기에 우리가 설명, 세부 사항, 장 배달 다음 몇 시간 동안 림프 시스템을 통해 속도와 지질 및 약물 수송의 정도의 평가를 할 수있는 장간막 림프절 덕트 유관 쥐 모델. 방법은 림프 다른 파라미터의 측정에 용이하게 적응할 수있다. 우리는 실험 성공을 확인하고 얻은 데이터를 해석하는 방법에 대한 교육을 제공하기 위해이 복잡한 수술 방법을 설정할 때 발생할 수있는 문제에 대한 자세한 설명뿐만 아니라, 실패와 성공의 실험에서 대표 데이터를 제공합니다.

서론

림프는 각 소장 융모 1에 포함 된 단일 lacteals에서 유래 단방향 프로세스를 통해 소장에서 흐른다. Lacteals 따라서 유체, 거대 분자 및 세포 림프 형성에 상대적으로 투과성 lacteals에 이러한 요소의 항목으로 시작한다. lacteals의 초기 림프 이후 림프 미세 혈관의 네트워크, 수집 (구 심성) 림프관, 장간막 림프절 궁극적으로 사후 노드 (원심성) 림프 혈관의 시리즈를 통해 소장에서 흐른다. 노드 내 림프 교환 혈액에서 노드를 입력 노드에 상주 면역 세포뿐만 아니라 물질로 발생하는 수질 부비동의 시리즈를 통해 전달합니다. 소장에서 흐르는 모든 림프 결국 원심성 장간막 림프절 덕트 및 이후 치스 테르 나디 라티 나에 chyli에 수렴한다. 치스 테르 나디 라티 나에 chyli 또한 림프 꼬리 주변 조직을 배출, intest를 수집원고 판은, 간 및 요추 지역과는 종격동과 몸의 뇌 부분에서 림프와 함께 흉부 림프 덕트를 결합한다. 흉부 림프 덕트는 왼쪽 경정맥과 쇄골 하 정맥의 교차점에 정맥 시스템에 직접 림프를 비 웁니다. 장간막 림프절에서 직접 림프 덕트의 수집을 가능하게 기재되어있는 프로토콜, 따라서 장 림프계를 통해 전신 (일반)에 순환 부위에서 직접 천이 다양한 인자의 분석을 용이하게한다.

장내 림프계에 할당 중요한 생리 학적 기능은 유체 밸런스를 유지하기 위해 지질 친 유성 분자의 흡수를 용이하게하기 위해, 적절한 한 면역 반응을 활성화한다. 종양 세포와 바이러스는 2-4 및 주요 변경 사항은 여러 가지 염증 및 대사 병리 5-7 림프관 내에서 발생하는 장 림프관을 통해 전파. 수장간막 다양한 세포 및 분자의 농도 및 전송 속도의 장 림프관을 통한 벌크 유체 흐름의 분석뿐만 아니라 정량을 가능 장간막 림프절 내에 덕트 nulation은 림프를 수집한다. 다양한 문제 (예를 들면, 다이어트, 항원, 약물)과 질병 모델에 대한 응답으로 농도 또는 이러한 요소의 대중 교통에 대한 변경 사항은 (예를 들어, 대장염, HIV, 당뇨병)도 평가 될 수있다. 이 광범위하게 분석하고 여기에 비교 될 수있다 각 림프 구성 요소를 설명하는 것은 불가능 동안, 장간막 림프절은 단순하게 수성, 지질 및 세포 단계로 구성된다. 성상에 대한 관심의 구성 요소는 항원 또는 tolerogens 8, 사이토 카인 및 비만 세포 매개 (9), 및 인크 레틴 10 대사 매개 면역 메신저로 펩타이드 및 단백질을 포함한다. 포스트 마디 장간막 림프절의 세포 분획 lymphocyt의 (99 %), 거의 전적으로 구성되어ES (11). 다양한 면역 세포 (수지상 세포, 비만 세포, 등)은 사전 마디 장간막 임파선를 입력하지만 노드 (12) 내에 남아있다. 심성 림프 세포 내의 관심있는 경우, 장간막 림프절의 제거를 통해 이러한 세포를 수집 할 수있다 장간막 림프절 덕트 (12)의 삽관 전에 몇 일 노드. 이러한 방식으로, 구 심성, 원심성 및 림프 도관에 직접 연결되고 심성 림프에서 임파구는 장간막 림프절 도관에 직접 전달한다. 장 림프관 통과 다양한 면역 세포의 표현형 및 운송 따라서 검사 할 수있다. 아마도 현재까지 장간막 림프절을 수집하기위한 인용 가장 일반적인 이유는, 그러나, 처리 장내 흡수식이 지질 친 유성 분자 (10)의 수송을 연구하는 것이다.

섭취 후,식이 지질은, 예를 들면, 트리글리 세라이드의 지방산과 모노 글리세리드, phosp로 (소화지방산 및 리소 인지질, 지방산 및 콜레스테롤 등) 콜레스테롤 에스테르로 holipid 담즙에서 양친의 첨가를 통해 작은 미셀 포성 구조로 장내 루멘 내에 분산 (인지질, 콜레스테롤 및 담즙 염)과의 작용 췌장 효소 (10, 13). 여기에서 그들은 장 세포로 흡수된다. 흡수 성분의 비율은, 흡수성 세포 (장 세포) 내 트리글리 세라이드, 인지질 및 콜레스테롤 에스테르를 형성하기 위해 재 에스테르 화. 이러한 재 - 에스테르 화 된 지질은 담즙 분비, 점막 지질 풀 또는 장내 혈액 (13)로부터 공급 외생 섭취 지질 성분 및 내인성 지질 성분의 조합으로부터 조립된다. 여기에서, 에스테르 화 지질 어느 장 세포 내에 저장되어 있거나 함께 다양 아포 단백질과 다른 분자와의 친 유성 장내 지단백질 (칠로 마이크론, 초 저밀도 지단백질 (VLDL)) (조립 예를 들어, 비타민) (10, 13). 장 lacteals이 장 모세 혈관보다 자신의 항목 침투성이 더으로 장 세포를 종료 한 후, 지질 단백질은 특히 장간막 림프 시스템을 통해 전신 순환 장에서 수송된다. 흡수 된 지질 성분의 비율은 또한, 관련되지 않은 단일 지단백질 모세 혈관과 간문맥 통해 체순환으로 소장에서 반송 14 분자이다. 그러나, 일반적으로, 간문맥 수송로 짧고 중간 사슬 길이 지질의 흡수에만 상당한 플레이어이다.

장간막 림프절의 컬렉션은 따라서 소장에서 지질 단백질 및 관련 구성 요소 (지질, 친 유성 분자, 아포 단백질)의 전송에 대한 평가를 할 수 있습니다. 지단백질 정량화 및 장간막 임파선 지단백질, 일반적 nascen에 유리하게 특성화 될 수있다t 상태 그들은 광범위하게 이러한 지단백 리파제 (15) 전신 효소에 의해 수정되지 않은 때문이다. 장간막 림프절 삽관 된 래트 모델은 아마도 역사적으로 가장 광범위 소장에서 지질 / 지단백 교통 분석에 기술 된 반면, 관심을 확대 영역은 지용성 약물, 전구 약물 및 다른 생체이 13,16의 수송 림프관의 역할은 여기에서 설명하는 모델의 초점이다. (일반적으로 긴 사슬 중성 지방> 50 ㎎ / g에서 로그 P> 5 용해도의 예외가 분명 있지만) 친 유성 약 17, 18, ​​19 및 기타 생체이 13, 16 중 하나를 수동적으로 또는하여 장 림프관에 액세스 할 수 있습니다 드럭 적극적으로 장 지단백 전송 경로 (19)에 통합.

쥐 장간막 림프절 삽관 기술은 이렇게 많은 응용 프로그램이 있습니다. 볼만 등 알. 먼저 techniq 설명변형 모델의 다음 번호가 설명 되었기 때문에 단말. 1948 20 래트에서 장간막 림프절 덕트 cannulate한다. 쥐 다양한 마취제 (21, 22)로 마취 할 때 예를 들어, 수집이 발생할 수 있습니다, 또는 의식 상태에있는 동안은 (23, 24)를 이동 15 자유롭게을 억제. (- 5 ㎖ / hr로 대개 0) 25 래트 재수 다른 솔루션과 같은 위장, 소장 또는 비경 다른 속도로 지질 및 약물 제제와 같은 다른 물질을 투여 할 수있다. 몇몇 연구에서는 흉부 림프 덕트보다는 장간막 림프절 덕트 흉부 림프 덕트는 서로 림프를 받으면이 관심 요인에 따라, 소장에서 운송 과대 수도 있지만, 림프관을 통해 소장에서 전송을 추정 삽관 지역 22, 26. 림프 삽관 모델은 쥐 15,27, 미니 PI 등 여러 가지 다른 종에서 기술 된GS 12, 양 28, 29, 돼지 30 개 (31). 그러나, 래트 모델은 가장 널리 일관 인용. 의식이 25 림프의 수집 뒤에 또는 22 쥐 15,27을 마취 장간막 림프절 덕트의 삽관에 대한 자세한 프로토콜은 이전에 출판되었으며, 관심있는 독자는 이러한 프로토콜에 관한 것이다. 이 프로토콜은 시각화 형식으로 기술을 보여 처음이다.

림프 삽관 된 래트 모델은, 비용면에서 수술 윤리적 고려 용이성 큰 동물 모델에 비해 이점을 갖는다. 마우스 모델에 비해 마우스 모델은 트랜스 제닉 동물 (27)에서 더 상세한 연구를 가능하게하더라도, 장간막 림프절 삽관 수술은 또한 쥐 쉽다. 그럼에도 불구하고, 쥐 모델, 생리의 차이와 관련된 특히, 그 한계 extrapolat의 몇 가지 제한 사항이 있습니다다른 전임상 및 임상 상황에 이온. 예를 들어, 쥐 담즙 흐름에 상수 및 높은 종 식품 반면 식품 섭취 또는 지질 독립적 담즙 흐름 (32)를 자극한다. 이것은 큰 종과 인간에서 볼 반영 쥐의 대표 사전 및 식후 환경을 얻기에 어려움을 만듭니다. 현실적인 인간의 투여 량의 투여 25을 형성 한 후 림프 전송을 평가할 때 약물 전달 연구의 경우, 큰 종은 또한 바람직 할 수있다. 최근 연구에서, 장간막 림프절에서 지질 전송 속도는 종 (27)에 걸쳐 지질 전송 데이터를 외삽에 자신감을 제공하는 등가 질량과 지질의 종류를 투여 한 후 종 (마우스, 쥐, 개)에 걸쳐 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 동물의 크기 (즉, 개> 쥐> 마우스)의 순서로 순위 모델 지용성 약물, 할로 판 트린의 전송. 스케일링 인자 따라서 EX해야 할 수도다른 종 쥐에서 임파 약물 전송 데이터인지 추정.

림프 삽관 모델의 제한은, 일반적으로, 림프관은 용기 (33)를 캐 뉼러를 한번 변경되는 압력 구배에 반대 보낸 림프 흐름 및 전송을 수정할 수 림프관부터 직접 해당 수동 림프 컬렉션이다. 림프 삽관 모델은 기술에 익숙하지 않은 실험실에서 파악하는 작업이 쉽지 않을 수도 있습니다. 대체 모델은 따라서 설명되었다. 예를 들면, 지질 단백질 및 친 유성 분자로서 장내 림프계를 통해 요인 통과 간접적 혈액의 컬렉션을 통해 연구되어왔다. 그러한 모델 오랄 존재 관리 및 억제제의 부재 다음과 같은 지질 및 / 또는 약물의 혈중 농도를 비교 포함한다 (예를 들면, 콜히친, 플루 L81, 사이클로 헥시) 림프 전송 블록 34 장 지질 단백질 생산. 장점혈액 샘플 수집을 통해 간접적으로 림프 전송을 정량화 모델의 침습 수술이 35 필요하지 않습니다으로는 인간의 림프 수송의 어떤 평가를 할 수 있다는 것입니다. 그러나, 림프 교통 억제제는 특정하지 않은 및 림프관을 통해 수송된다 요인이 희석과 같은 평가를 복잡하게 전신 순환에 수정됩니다. 체외 대안도 설명 하였다. 예를 들어, 카코 -2 세포 또는 격리 장 세포 배양 물보다 상세히 림프관 36-38 입력 분자의 장내 분비를 연구하기 위해 사용되어왔다. 인간의 장내 미세보다 잘 나타내는 고급 체외 모델은 최근 39 설명했다. 이 모델에서 림프관 내피 세포층 림프관으로 소장에서 물질 전달의보다 상세한 분석이 가능 카코 -2 세포와 공 배양된다. 그러나, vitr에서오 전지 시스템은 교환 흐름을 부족 및 장 루멘과 기본 혈액과 림프 혈관 공급 즉, 상호 연결을 전송합니다. 대안적인 접근법에서, Kassis는 외. 혈관 수축, 림프 흐름 및 장간막 림프관 33 형광 지질 농도 사이의 양적 비교를 가능 시츄 촬상 시스템의 듀얼 채널 (고속 명 시야 화상과 형광)을 설치했다. 시험 관내 시스템에서의 상기 이상이 모델의 이점은 림프관을 통한 면역 세포의 통로의 정확한 추적을 가능하게한다는 것이다. 대량 지질 (또는 약물) 전송의 절대 측정은, 그러나, 아직 이미징 방법을 사용하여 설립. 시험관과 실리에 구체적으로도 40 ~ 42을 게시 한 장 림프관을 통해 친 유성 약물 수송의 정도를 예측하기 위해 접근되지 않습니다. (C)의 여러 예를 들어, 생체 친 화성플라즈마 카일로 마이크론에 대한 ompounds 생체 (41)에서의 림프 전송으로 합리적으로 상관 관계가 밝혀졌다. 이어서, 동일 그룹들은 다수의 물리 화학적 특성에 기초하여 40 킬로 미크론 치료약 친 화성을 ​​예측하기 실리 모델을 확립. 홀름 등. 또한 명백한 분자량 디스크립터 (42)의 기초 림프 친 유성 화합물의 수송을 예측 모델에 실리 비교적 복잡한 설립. 이러한 모델은 알려지지 약물 수송 림프관의 정도를 예측하기위한 유용한 방법을 제공 할 수있다. 약물 및 다른 실험실에 걸쳐 광범위한 모델 검증 그러나, 정확성 및 재현성을 확인하기 위해 필요할 것이다.

장간막 림프절 덕트 삽관 따라서 직접 소장 및 인자 (세포 단백질의 복소 배열의 운송 속도를 배수 림프절의 내용을 검사 할 수있는 유일한 수단 남아생체 내 상황에서 림프 펩타이드, 지질, 약물). 여기에서 우리는 장간막 림프절 및 마취 쥐 전신 혈액의 수집을 가능하게하는 장간막 림프절 덕트 및 경동맥 동맥 삽관을위한 프로토콜을 설명합니다. 대표 데이터는 모델 장간막 림프계를 통해 소장에서 지질 및 약물 수송을 검사 할 수있는 방법을 보여준다. 이 모델과 문제 해결 가이드를 확립 발생할 수있는 문제에 대한 논의가옵니다. 설립되면 모델은 장 림프 전송을 조사하는 강력한 도구입니다.

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프로토콜

이 논문에 기술 된 연구는 지역의 동물 윤리위원회의 승인을하고, 연구 및 교육 지침에 동물의 관리에 대한 호주와 뉴질랜드위원회에 따라 실시 하였다. 모든 동물의 절차를 시작하기 전에 적절한 권한 로컬 기관 / 조직을 통해 얻을 수 있는지 확인합니다. 모든 동물 수술과 마찬가지로 수술은 무균 조건에서 윤리적이고 성공적인 결과를 보장하기 위해 필요한 경우 마취제, 진통제와 항생제 투여되어, 적절히 훈련 된 운영자에 의해 수행되어 있는지 확인합니다.

1. 준비 일 수술 전에

  1. 필요한 경우 수술 전에 쥐에게 밤을 고속으로. 쥐를 확인하는 것은 물에 무료로 액세스 할 수 있습니다.
  2. 준비 솔루션은 쥐에 투여한다.
    1. 멸균 식염수 또는 링거 용액으로 재수 솔루션을 준비합니다.
    2. 준비심미적 솔루션은 필요에 따라. 여기에 기술 된 실험에 사용 마취제 "케타민 100 mg을 1.9 ㎖ / ㎖, 크 실라 100 ㎎ / ㎖, 0.5 ㎖, ml의 아세 프로 마진 10 ㎎ / 0.2 ㎖의 생리 식염수를 2.5 ㎖의 결합에 의해"칵테일 1 "제조 이루어져 케타민 100 ㎖ ㎎ / 0.1 ml의 아세 프로 마진 10 ㎎ / ㎖ 1 ㎖ 이루어진 칵테일 2 ". 주 : 오랜 기간 동안, 수술 적 단계의 마취를 제공 할 수있다 흡입 이소 플루 란으로 또는 세보이 바람직 할 수있다.
    3. 임의로, 예를 들면, 지질 에멀젼에 약물을 함유하는 제형을 제조. 저장 및 투여 기간 동안 제제의 안정성을 보장하기 위해 적합한 안정성 시험을 수행한다.
      주 : 제형 및 약물의 정확한 본질은 림프 약물 수송 연구 목적 각 연구에 따라 달라질 투여되는 제제 및 약물 admini의 함수로서 림프 약물 수송의 효율을 평가하기 위해 가장 자주stered.
      1. 앞서 설명한 바와 같이 43도 4 및도 5에 여기 대표적인 실험에 사용 제형을 제조한다. 간략하게, 인산 완충 생리 식염수 (PH 6.9)에 5 mM의 나트륨 타우로 콜산으로 이루어지는 성상 5.6 ㎖에 분산하기 전에 14 C 올레산 (μCi를 2-5) 및 40 mg의 올레산으로 할로 판 트린 (200 μg의)를 통합한다.
      2. 2 모노 올레 인을 함유하는 제제의 경우, 올레산 위상 함유 할로 판 트린과 동시에 수성 상에, 다른 구성 요소와 함께 2 모노 올레 인 7.1 mg의 추가. 2 모노 올레 비교적 불안정 1- 모노 올레로 isomerises으로 래트에게 투여 직전에 2 모노 올레 인을 함유하는 제형을 준비한다.
      3. 그 후 실온에서 2 분 동안 초음파에 의해 제제를 유화.
        참고 : 43 이전에 설명한 바와 같이)의 에뮬레이션을 육안 검사에 의해 I 제형의 안정성을 모니터링편광 하에서 시온의 제조 직후 및 상 변화 및 ​​/ 또는 분리의 표시를 제공하기 위해 동적 광산란을 사용하여 투여 후 에멀젼 상 분리하지 않은 것, ⅱ) 입자 크기 분석을 보장하고, 할로 판 트린 농도 ⅲ) 분석에 사용하기위한 검증 된 HPLC 분석.
  3. 림프 캐 뉼러를 세척하는 식염수에 항응고제 10 ㎎을 함유 용액 / ml의 EDTA 멸균 또는 10 IU / ml의 헤파린을 준비합니다. 경동맥 캐뉼라를 플러시 식염수 10 IU / ㎖ 헤파린 - 2.5을 함유하는 항 - 응고제 용액을 제조 하였다.
  4. 장간막 림프절 덕트 (0.8 mm 외경 0.5 mm의 ID), 경동맥 (0.96 mm의 OD, 0.58 mm ID 또는 0.8 mm OD 0.5 mm의 ID) 및 십이지장 (0.96 mm 외경, 0.58 mm의 ID에 삽입 폴리에틸렌 캐 뉼러를 준비 )
    1. 림프 CANN 15 CM - 경동맥 및 십이지장 정맥 10 30 CM - 필요한 길이 (일반적으로 25 캐 뉼러를 잘라울라)와 () 그림 1 참조 멸균 수술 블레이드를 사용하여 캐 뉼러의 끝에서 경사를 놓습니다.
      참고 :이 캐뉼라를 삽입의 용이성을 증가시키고 정맥 폐색 후 삽입의 발생을 줄일 수 있습니다.
    2. 크기로 절단 한 후, 다시 자체에 캐 뉼러의 작은 부분을 반복 밝거나 핫 플레이트로 가열하여 십이지장 정맥에 J 모양 기준점 (그림 1 참조).
  5. (단계 1.3에서 준비) 항응고제 솔루션을 포함하는 25 G 바늘과 주사기에 림프 정맥을 연결합니다. 항 응고제 용액으로 림프 캐 뉼러를 입력하고 정맥 O에서 솔루션을 떠나 / N은 ​​림프를 수집하는 동안 림프 정맥에 혈전 형성의 발생을 줄일 수 있습니다.
  6. 림프 및 혈액 샘플 수집을위한 튜브를 준비합니다. 림프 및 혈액 샘플 수집을 위해 림프 수집 튜브, 라벨 튜브를 사전 무게 항응고제 솔루션을 추가합니다. 충분한 항응고제 오디오 솔루션을 추가수집 된 림프 나 혈액에서 20 IU / ml의 헤파린 - 이온 살균 물에 1 ㎎ / ㎖ EDTA의 최종 농도 10을 달성했다.

수술 절차를 시작하기 2. 준비 직전

  1. 그들은 특허 있는지 확인하기 위해 멸균 식염수 또는 항 응고제 용액으로 세척하여 모든 캐 뉼러를 확인합니다.
  2. 수술에 대한 쥐를 준비합니다.
    참고 : 장간막 림프절 덕트 먹은 또는 장간막 림프절 밀키 이상 지질 로딩 불투명 한대로 기름의 복용량을 투여 한 쥐에서 더 볼 수 있습니다. 앞서 개시 수술 2 시간 - 올리브유 또는 대두유 0.5로서 - (1 ㎖를 0.1 주위)의 일부 운영자들은, 특히 수술 새로운 그 때문에 래트 오일 미리 투여한다 때 쉽게 장간막 림프절 덕트 cannulate 찾을 . 그러나, 미리 투여 오일은 오일 량을 미리하는 것이 이상적하지 않을 수 있도록 림프 지질, 지용성 약물 및 기타 요인의 림프 전송에 영향을 미치는실험 목적에 따라.
    1. 수술 및 샘플 수집 기간 동안 쥐를 마취.
      1. 예를 들어, 칵테일 1.5 ㎖ / kg의 피하 주사를 통해 마취를 개시 I 25 G 바늘에 부착 한 ML의 주사기를 이용하여 쥐의 목 뒤쪽에 피부 주름으로한다 (단계 1.2.2부터). (단계 1.2.2에서) 칵테일 2의 0.44 ㎖ / ㎏ 25 G 바늘에 부착 된 1 ML의 주사기를 사용하여, 필요에 따라 대략 각 시간의 복강 내 주사를 통해 마취를 유지한다.
      2. 수술 마취의 깊이 호흡, 수염 운동, 근육 및 다리의 곤란 등의 자극에 대한 반응을 관찰하여 충분한 지 확인 시작하기 전에. 필요에 따라 추가 마취를 관리.
    2. 경동맥 동맥 정맥에 대한 림프 및 십이지장 삽관의 복부의 오른쪽을 포함 외과 영역에서 모피, 목과 왼쪽 쇄골 부위를 면도기.
    3. 무균 povidine 요오드 용액이나 클로르헥시딘 용액과 70 % 에탄올 스크럽을 사용하여 수술 영역을 청소합니다. 70 % 에탄올로 최종 클렌징으로 마무리, 각 지역이 3 번 반복합니다.
  3. 가열 수술 패드 (37 ° C) 이상 깨끗한 시트에 지느러미로 누워있는 동물을 놓습니다.

장간막 림프 덕트 3. 캐 뉼러

  1. 우측 운영자쪽으로 향하게하여 동물을 놓습니다. 또는 필요에 따라 수술 현미경의 도움없이 수술을 수행합니다.
  2. 직선 4cm 절개가 약 2cm 갈비뼈 (늑골 마진) 아래의 오른쪽 측면에 중간 선 (xyphoid 과정)에서 연장 멸균 메스 블레이드를 이용하여 복부 근육 벽의 상단 레이어를 엽니 다 (그림 2B 참조).
  3. 작은 쌍의 오른쪽 측면에 정중선에 측면 4-5mm 복부 근육 벽의 나머지 층을 엽니 다외과 위의 (그림 2B 참조).
  4. 왼쪽 복부 근육 벽에서 소장을 후퇴 2 사용 장소에 보관 - 생리 식염수로 포화 멸균 거즈의 3 조각.
  5. 장간막 림프절 덕트의 시각화를 완화 오른쪽 신장의 수준에서 쥐의 등 아래에 수평으로 배치 된 10 ML의 플라스틱 주사기를 통해 쥐를 다리.
  6. - (도 2C를 참조 맥동 어두운 붉은 혈관) 장간막 동맥의 권리 신장에 수직 즉시 주동이와 평행 직경 1mm 선박 약 0.5 : 장간막 림프절 덕트를 찾습니다.
    참고 : 비 금식 또는 오일 프리 투여 된 쥐에서 선박이 불투명 한 흰색과 아주 반투명 인 금식 쥐보다 더 쉽게 시각화 할 수 있습니다.
  7. 둘째, 작은 액세서리 림프 덕트인지 확인하기 위해 큰 장간막 림프절 덕트 및 장간막 동맥에 바로 꼬리 영역을 검사현재. 본 경우에는, 덕트를 절단하고 superglue으로 폐색 또는 도관 주위의 봉합을 묶어서 덕트를 통해 림프의 유동을 차단하는 부위에서 흐르는 림프의 전체 볼륨은 장간막 림프절 덕트로부터 수집되는 것을 보장하기 위해.
  8. 오른쪽 신장의 하부 여백 조갑 신장 지방 상을 통해 직선 포셉 쌍을 전달하고 장간막 림프절 덕트와 평행 한 방향으로 즉시 대정맥 아래 결합 조직 층, 관통.
  9. 집게의 끝이 림프 정맥의 보류를 가지고 한쪽 끝을 즉시 장간막 림프절 덕트에 인접하고 오른쪽 신장의 수준에서 동물로부터 exteriorised 서로 근교 신장 지방 베드를 당겨 사용.
  10. 무딘 절개에 의해 결합과 지방 조직의 층 위에 놓인에서 장간막 림프절 덕트를 분리합니다. 구멍을 뚫거나 림프 덕트 손상되지 않도록주의하십시오.
  11. 림프 덕트를 분리 한 후, 작은 호를 만들마이크로 가위, 보석상의 집게의 날카로운 끝이나 25 G 바늘 하나와 림프 덕트 르. 완전히 선박을 절단하지 않도록주의하십시오.
  12. 림프 정맥이 완전히없는 공기 갭 항 응고제 용액 (주사기를 사용하여 25 G 바늘) 충전되어 있는지 확인합니다. 포셉의 작은 쌍의 도움으로 작은 구멍을 통해 장간막 림프절 덕트 내부에 4mm - 림프 정맥에게 약 2를 삽입합니다.
  13. 몇 분 림프 정맥을 준수하십시오. 삽관이 성공한 경우 뉼러의 자유 단부로부터 수집 장 림프의 유동을 점진적으로 관찰한다. 3.12 - 삽관에 실패하면, 반복 3.8 단계를 반복합니다.
  14. 삽관이 성공적이면, 림프 덕트 내로 진입 구멍 위에 수의학 접착제의 작은 방울을 배치하여 캐 뉼러를 고정. 초과 수의학 접착제의 응용 프로그램을 통해 선박을 막다 않도록주의하십시오.
  15. 수의학 접착제가 설정 기다리고, obser 동안삽관 절차가 성공적으로 완료되었는지 확인하기 위해 몇 분 동안 림프의 흐름을했습니다. 삽관의 특정되면 성공 신중 복강에 넣고 거즈 조각을 제거하고 원래의 위치에 배치 소장.
  16. 항응고제를 포함하는 림프 포집 관을 배치 림프 자유 유동을 수집하는 캐 뉼러의 단부 (단계 1.6 참조).
  17. 다음으로, 재수 솔루션 및 / 또는 제제의 주입을위한 십이지장을 cannulate.

십이지장 4. 캐 뉼러

  1. 수분 보충 용액으로 가득 주사기 (예를 들어, 10 ㎖)에 십이지장 정맥을 연결합니다.
  2. 당기 부드러운 아래에 배를 밝혀 소장의 섹션 (자세한 혈관과) 밝은 분홍색으로 십이지장을 확인합니다.
  3. 약 2cm 위장과 십이지장 (유문)의 접합 아래 십이지장에있는 작은 구멍 구멍을 사용하여멸균 23 G 바늘.
  4. 구멍 구멍을 통해 십이지장 정맥의 J 모양의 후크 끝을 삽입합니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 한 방울 제자리에 고정합니다.
  5. 주입 펌프에 공급 된 수분 보충 주사기로 정맥을 연결하여 쥐의 수화를 개시합니다. 문헌에 따르면 재수 속도 범위는 0.5-3 ㎖ / 시간 15, 25.
  6. 림프 십이지장 삽관의 종료 후, 봉합으로 복근 벽에 절개를 닫는다. 이어서 절개면을 따라 조직 접착제 (시아 노 아크릴 레이트) 몇 방울을 도포하고, 함께 절개 양쪽 피부를 집어 피부 절개를 닫는다.

경동맥 5. 캐 뉼러

경동맥 삽관 전 또는 장간막 림프절 덕트 삽관 후에 수행 될 수있다. 일부 운영자들은 종래 PO 작아 지도록 림프 덕트 cannulating로 경동맥을 선호 cannulate동물을 이동하는 경우에 잠재적 인 림프 정맥을 빠지.

  1. 동맥에 삽입하는 튜브의 부분을 식별 할 베벨 끝에서 경동맥 동맥 정맥에 2.5 cm를 표시를합니다. 항 응고제 용액으로 가득 주사기에 부착 된 23 또는 25 G 바늘에 (베벨이없는 즉,) 캐 뉼러의 다른 쪽 끝을 연결하고 항응고제 솔루션은 공기 갭이 존재하지 않는 확인한와 캐 뉼러를 입력합니다.
  2. 삽관을 용이하게하기 위해, 운영자 향하게 뻗어 목과 머리와 지느러미 드러 누움에 마취 된 쥐를 놓습니다. 일부 사업자는 쥐의 꼬리가 운전자쪽으로 가리키는이 기술을 수행하는 것을 선호합니다.
  3. 시상면에서 기관의 왼쪽 위의 피부 층을 1.5 cm 길이의 절개 - 1 놓습니다.
  4. 기본적인 쌍의 목 근육을 노출 무딘 팁 집게를 사용하여 피하 결합 조직의 해부.
  5. 목 근육의 t 후퇴O (~ 1cm 피부 표면과 펄스 아래) 왼쪽 경동맥을 알 수있다. 무딘 절개하여 동맥에서 위에있는 결합 조직을 청소합니다.
  6. 조심스럽게 인접한 미주 신경 트랙이 손상되지 않도록주의하면서 무딘 조직 집게를 사용하여 동맥 ~ 1cm 부분을 분리합니다. 개방과 주변 조직과 미주 신경에서 잘 나오도록 동맥 중 어느 쪽을 따라 수직으로 무딘 팁 집게를 폐쇄하여이 작업을 수행합니다.
  7. 좋은 팁 집게를 사용하여, 경동맥 아래에 두 개의 실크 봉합사 스레드와 분리 된 동맥 부분의 양쪽 끝 부분에 배치합니다. 쥐의 심장과 쇄골 (그림 3A)로부터 작업자와 멀리에 봉합에 가장 가까운을 묶어.
  8. 동맥 (그림 3B) 아래에 똑바로 잘 팁 포셉 한 쌍을 배치하여 동맥을 통해 혈액의 흐름을 막다.
  9. 미세한 팁 홍채 가위를 사용하여 동맥 (약 1/3의 상면에 작은 절개를 배치길 아래로 고립 된 지역의 상단에서). 헤파린 식염수 동맥의 표면에 어떤 기록 된 혈액을 세척하고 부드럽게면 정보를 사용하여 닦아주십시오.
  10. 곡선 팁 포셉 한 쌍의 동맥에 정맥의 끝을 삽입합니다. 일단 삽입 혈류를 폐색 직선 미세한 팁 집게를 제거하고 캐 뉼러를 삽입 뒤로 다른 누설 혈액을 중지 동맥 내부 캐 뉼러를 보유하는 두 집게 쌍, 하나를 사용하여 동맥에 캐뉼라 2.5 cm를 전진.
  11. 동맥 내부의 정맥을 보유하고 혈액의 흐름을 막다 단계 5.8에서 동맥 아래에 배치 된 직선 미세 팁 집게를 제거하는 작은 동맥 클램프를 사용합니다.
  12. 캐 뉼러에 항 응고제 용액을 주입하고 소량의 혈액 (그림 3C)를 다시 그려 정맥의 ​​개통을 확인합니다. 이어서 항응고제 용액으로 세척 한 후 캐 뉼러 라이터의 불꽃이나 캐 뉼러를 이용하여 플러그 단부를 밀봉.
  13. 일 타이단계 5.8에서 동맥 아래에 배치 두 봉합과 장소에 전자 정맥.
  14. 동맥 클램프를 제거하고 동맥과 정맥 주위에 세 번째 봉합을 확보. 봉합 상처 목을 닫습니다.

6. 후 수술 기간 및 제제 주입

  1. 마취하고 가열 패드의 쥐를 유지하기 위해 계속합니다.
  2. 삽관 완료 후 적어도 0.5 시간 동안 십이지장에 수분 보충 용액의 주입을 통해 쥐를 재수. 삽관 다음과 같은 초기 기간 동안 - (0.5 ㎖ / 시간 ~ 0.1) 곧 일정한 기준에 증가 림프 유량 감소를 관찰 (0.4-2.5 ㎖ / 시간이 재수 속도에 따라 다름).
  3. 회복 기간 후, 캐 뉼러를 통하여 십이지장 (지질, 약물 등을 포함하는) 관심 제형 달이다. 선택적으로, 제제의 유량을 조절하는 주입 펌프를 사용한다. 참고 : 프로토콜이 여기에 설명에서 동물 anaes 남아수술과 림프 수집 기간 동안 thetised 추가 진통이 요구되지 않도록 마취 euthanised된다. 프로토콜은 수정과 동물은 적절한 마취 및 수술 후 관리가 필요합니다 후 의식을 회복하기 위해 사용할 수있는 경우.
  4. 제제 주입 완료시 탈수를 방지하기 위해, 십이지장 내로 생리 식염수와 1.5-3 ㎖ / hr의 속도로 쥐를 재수 계속.
  5. 필요에 따라 하복부에 부드러운 아래쪽으로 밀어 넣기를 통해 방광에서, (단계 2.3에 따라) 온도를 유지하기 위해 37 ℃ 가열 수술 패드에 명시 소변을 쥐을 유지하고 단계 2.2에 따라 (안과 연고마다 시간을 다시 적용하기 위해 계속합니다. 3). 동물이 시술 후 의식을 회복하는 경우 정기적 인 자세 변경하는 것이 좋습니다.

림프 및 혈액 샘플 7. 컬렉션은 지질 및 약물 흡수를 평가하기 위해

  1. 지속적으로 림프를 수집항응고제를 포함하는 튜브. 필요한 시간 간격 변경 튜브 (예를 들면, 시간별).
  2. 설정된 시점에서 혈액 샘플을 수집.
    1. 다시 대략 밀폐 단부로부터 2cm를 캐 뉼러를 절곡하여 캐뉼라를 통한 혈류를 폐색. 밀봉 단부를 절단 또는 캐뉼라 플러그를 제거함으로써 캐 뉼러 개봉.
    2. 전체 혈액이 정맥을 채울 때까지 빈 주사기를 사용하여, 캐 뉼러로부터​​ 헤파린 염수를 철회.
    3. 새로운 빈 주사기를 사용, 항응고제를 포함하는 튜브에 혈액과 장소의 원하는 볼륨을 철회.
    4. 제 주사기를 사용, 불필요한 혈액 손실을 감소시키기 전에 샘플링 취한 혈액을 대체. 그것이 직립 공기 방울이 뉼러를 입력하지 않도록 채 주입 전에 주사기를 쓸어.
    5. 주사기를 사용하여, 항응고제 용액으로부터 제거 래트 혈액의 체적을 대체. 어떤이 응고 할 수 나머지으로 잔여 혈액이 정맥에서 볼 수 없는지 확인과 정맥을 차단합니다.
    6. 벤드는 정맥 봉인 끝에서 약 2cm 혈액 흐름을 차단하고 주사기를 제거합니다. 라이터의 불꽃 뉼러 플러그를 사용하여, 캐 뉼러를 봉인.
  3. 쥐로부터 혈액 및 림프의 수집 완료시> 100 ㎎ / kg 나트륨 펜토 바르비 복강 투여를 통하여 쥐를 안락사.
  4. 각각의 시간주기 동안 수집 된 림프의 질량을 측정하여 림프 유량을 결정한다.
  5. 지질 및 약물 흡수 효율을 평가하기 위해, 예를 들어, HPLC, HPLC-MS 또는 상업용 키트를 사용하기 위해, 혈액 및 림프 사용 약물과 지질의 농도를 측정한다.
  6. 수집 된 측정 농도 및 림프의 볼륨의 제품과 림프 약물과 지질의 대량 수송을 계산합니다.

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결과

대표적인 실험의 결과는도 4 및도 5에 도시되어 장간막 림프절 삽관 모델을 이용하여 장내 전달 다음 림프계를 통해 누적 범위와 지질 및 약물 수송 속도를 정량화한다.이 실험에서, 모델 친 유성 200 μg의를 포스페이트 완충에 5.6 ㎖의 5 mM의 나트륨 타우로 콜산에 분산 및 7.1 mg의 2 모노 올레 인 - 약물 할로 판 트린 40 mg의 올레산 (5 μCi를 14 C-올레산 2 포함) 아세트산 함유 제제에서 2 시간 동안 쥐의 십이지장 내로 투여했다 식염수의 pH가 6.9. 제제 투여 후 래트를 2.8 ㎖ / 십이지장 내로 주입 된 생리 식염수와 시간의 속도로 재수 화 하였다. 림프는 10 시간 동안 매 시간을 변경 튜브에 지속적으로 수집 하였다. 모두 동일한 COMPON 함유 제제에 대한 전술 한 프로토콜에 따라, 제형을 제조하고, 실험을 수행그것을 제외하고 엔트는 2 모노 올레 인 (43)을 포함하지 않았다.

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토론

쥐 장간막 림프절 삽관 모델은 다양한 물질로 도전하는 농도와 다양한 세포와​​ 소장에서 림프에 응답하여 발생하는 이들에 대한 변경 (예 : 지질 및 약물 등) 분자의 전송 속도를 직접 정량화 할 수 있습니다 (다이어트 항원 약물, 제형 등) 10,27 질병 (암, 바이러스, 대장염, 인슐린 저항성 등) 5-7. 림프 수집 성분은 또한 상기 추가의 실험에 이용 될 수있다. 예를 들어, 셀 (44), 분획 지질 단백질과 림프 또는 지질 단백질이나 세포와 같은 구성 요소는, 약물, 방사능 표지 및 형광 프로브를 포함하여 마커로드 배양 할 수있다. 이는 더 직접적으로 그 기능, 신진 대사, 통관 및 / 또는 조직 처분 패턴 45-47을 평가받는 동물로 재 주입 할 수 있습니다. 랫트 림프 삽관 모델 OTH 여러가지 장점을 갖는다어 시험관, 현장에서, 실리코, 그리고 생체 내 모델 도입에 설명 ...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

호주 연구 위원회(ARC)와 국립 보건 및 의학 연구 위원회(NHMRC)의 자금 지원에 감사드립니다.

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재료

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멸균 식염수Baxter healthcareAHB 1307모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 Baxter 100ml 식염수 백, 물
중 50 70 % 에탄올있습니다. 모든브랜드를 사용할 수 있습니다
. 클로르헥시딘 글루코네이트 용액 (Microshield 4)Livingstone InternationalJJ60243L모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
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Betadine 솔루션Livingstone InternationalBU0510모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
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일리움 케타밀(케타민 100mg/ml)프로벳 빅토리아 KETA I 1
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ACP 10 주사제(아세프로마진 10mg/ml)PROVET VICTORIA VTG-DACP010020
http://www.provet.com.au/ 펜토바르비톤나트륨빅토리아 프로벳24529모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 Lethabarb® 입니다. 325 mg/ml 펜토바르비톤나트륨, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
헤파린(35mL 중 35000IU)Sigma Pharmaceuticals337220
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폴리에틸렌(PE) 캐뉼라 외경 0.96mm x 내경 0.58mm마이크로튜브 연장부 PE8050모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 PE 튜빙 0.96 x0.58 mm, 30 m
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눈금자모든브랜드를 사용할 수 있습니다
마커모든브랜드를 사용할 수
라이터모든브랜드를 사용할 수
수의학 접착제모든브랜드를 사용할 수 있습니다
23 게이지 바늘리빙스턴 인터내셔널DN23GX0.75LV모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX가 있습니다. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
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25게이지 바늘Livingstone InternationalDN25GX1.0LV모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX가 있습니다. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1ml 주사기리빙스턴 인터내셔널T3SS01TA모든 브랜드에 사용할 수 있습니다. 예를 들면 Terumo 주사기 1ml 슬립 투베르쿨린 100/박스가 있습니다. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
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3/8 서클 리버스 컷 실크 봉합사 3/0 스레드 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
메스 블레이드Fine Science Tools (FST)10020-00모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 FST 메스 블레이드 #20이 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
메스 손잡이Fine Science Tools (FST)10004-13모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 다음은 FST 메스 핸들 #4의 예입니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x 소형 수술 용 가위Fine Science Tools (FST)14060-09모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 FST 파인 가위, 9cm, 21mm 절삭 날, 날카롭고 곧은 가위가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
톱니 모양의 곡선 팁이있는 집게 2 개Fine Science Tools (FST)11001-13모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 곡선 2.8x1.4mm 팁이 있는 FST 13cm 표준 패턴 집게가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x 홍채 절제술 가위Fine Science Tools (FST)15000-08모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 FST Vannas 스프링 가위-2.5mm 커팅 엣지, 스트레이트가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x 스트레이트 세레이트 팁이있는 집게Fine Science Tools (FST)11650-10모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 톱니 모양의 1 x 0.99mm 팁이있는 FST Graefe 10cm 직선입니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x 집게 매끄럽고 날카로운 직선 파인 팁Fine Science Tools (FST)11251-10모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 FST Dumont #5 핀셋 스트레이트 11cm, 팁 0.08 x 0.04mm가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x 집게 매끄럽고 미세한 곡선 집게Fine Science Tools (FST)11063-07모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 부드러운 9 x 0.4mm 팁이 있는 0.3cm의 FST 섬세한 집게가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x 지혈제정밀 과학 도구(FST)13010-12모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 모든 작업자가 지혈제를 사용하는 것은 아닙니다. 예를 들어 길이 20mm x 너비 1.3mm의 톱니 모양의 직선 팁을 가진 FST 12cm 마이크로 모기 지혈제입니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x 봉합사 바늘 홀더Fine Science Tools (FST)12001-13모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 길이 16mm x 너비 1.9mm 팁이 있는 FST 13cm Hasley 바늘 홀더가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x 동맥 클램프Fine Science Tools (FST)18050-28모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 FST Bulldog Serrefines 스트레이트, 길이 28mm, 턱 치수 9x1.6mm, 미디엄 클램프 프레스가 있습니다. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
올레산시그마 알드리치O1008필요한 경우 모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 99% 순수 올레산이 있습니다. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en®ion=AU
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타우로콜산나트륨시그마 알드리치T4009모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들면 타우로콜산, 나트륨 염 수화물, ≥ 95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en®ion=AU
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인산나트륨 단일염기성 시그마 Aldrich71507모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 분자 생물학을 위한 인산나트륨 일염기성 일수화물인 BioXtra는 >99.5%입니다. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en®ion=AU
인산나트륨 이염기성시그마 Aldrich71643모든 브랜드를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 분자 생물학을 위한 인산나트륨 이염기성 이수화물인 BioUltra는 >99%입니다. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en®ion=AU
상자가 ; 있습니다 담배 있습니다

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