방법 논문

BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

DOI:

10.3791/52419

⸱

2014년 11월 28일

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

이 논문에서

요약

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우리는 인간, 마우스 또는 쥐 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 구체적으로 측정하는 간단하고 정량적인 비색 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 인식 서열을 가진 다른 합성 펩타이드 기질의 가수분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

초록

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세린 프로테아제 Granzyme B(GzmB)는 세포독성 T 림프구(CTL) 또는 자연살해(NK) 세포에 의해 방출될 때 표적 세포 자멸사를 매개합니다. GzmB는 인간과 생쥐에서 가장 많이 연구된 그랜자임이므로 연구자들은 병태생리학에서 그 기능과 역할을 연구하기 위해 구체적이고 신뢰할 수 있는 도구가 필요합니다. 이는 특히 구조적 또는 기능적으로 관련된 카스파제(caspasé) 또는 다른 그랜자임(granzyme)과 같은 프로테아제를 인식하지 않는 분석을 필요로 합니다. 여기에서는 펩타이드 티오에스테르 Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl을 사용하여 비색 분석에서 아스파르트산 잔류 후 절단에 대한 GzmB의 선호를 적용합니다. GzmB는 이 기질을 절단할 수 있는 유일한 포유류 세린 프로테아제입니다. 기질은 인간, 마우스 및 쥐 GzmB에 의해 유사한 효율로 절단되며, 이는 상업적으로 이용 가능한 다른 펩타이드 기질과 공유되지 않는 특성이며, 이러한 목적에 적합한 것으로 광고되는 일부도 있습니다. 이 프로토콜은 활성화된 NK 세포 또는 CTL의 분획되지 않은 용해물을 사용하여 입증되었으며 올바른 대조군이 사용되는 경우 다양한 원핵 및 진핵 시스템에서 생성된 재조합 단백질 분해 효소에도 적합합니다. 이 분석은 포유류 림프구에서 세포독성 분자와 다양한 방법론으로 표현되는 재조합 분자의 잠재적인 세포사멸 활성을 확인하기 위한 매우 특이적인 방법입니다.

서론

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Granzymes 자연 킬러 (NK) 세포 및 세포 독성 T 림프구 (CTL) (1)의 분비 리소좀에서 발견되는 세린 프로테아제 패밀리이다. 다섯 가지 granzymes 인간 (A, B, H, K 및 M)에 존재하고, 마우스에서 십 (A - G, K, M 및 N) 2,3-. 그랜 자임과 그랜 자임 B (GzmA, GzmB)는 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 설치류 설정에서 조사되었다.

GzmB의 고전 함수는 표적 세포 사이토 졸로 액세스 4 그랜 자임을 허용 기공 형성 단백질 퍼포과 함께 실행되는 표적 세포에서 아폽토시스의 유도이다. GzmB 발현 명백하게 세포 상해 성 림프구에서 발견되지만, 최근의 연구는 호염기구 (6), 비만 세포 (7) 형질 수지상 세포 (8) 및 B 세포 (9)를 포함하지만, 케 라티노 사이트 (5)에 한정되지 않고, 다른 GzmB 발현 세포 유형의 다양한 어드레싱되었습니다 10.이러한 맥락에서, 비 세포 사멸 GzmB 기능은 염증 과정, 조직 리모델링과 다른 면역 특성 11-14 참여에 이르기까지 드러났다.

폭 넓은 생물학적 역할이 이전에 의심보다 GzmB 제안 된 것을 감안할 때, 연구자는 검출 신뢰성과 특정 도구가 필요합니다. 이점 진핵 세린 프로테아제 (15) 사이에서 고유 아스파르트 산 잔기, 속성의 카복실 측 쪼개지 GzmB의 특정 요구 사항이다. 마우스는 인간과 쥐 GzmB 그러나 마우스 GzmB의 확장 기질 특이성 터미널 (P1)에서의 ASP와 특정 일반 기판 GzmB 효율적으로 절단 할 수 있음을 의미 모두 인간과 쥐 16과는 미묘하게 다른, 구조적으로 매우 유사 세 종, 상류 P1의 더 복잡한 시퀀스와 다른 기판 반면 널리 변수 결과를 제공 할 수 있습니다. 과거 최신 리튬 둘terature,이 사실은주의 깊게 통제에도 불구하고, 상당한 혼란과 일부 실험 결과의 생물학적 의미의 오해가 발생했습니다, 운동 연구는 상황 (17)를 해결하기 위해 노력했다.

이 논문에서 우리는 두 가지 상업적으로 이용 가능한 기판, 즉 BOC-알라 - 알라 -의 ASP SBzl 및 N- 아세틸 일드 서열 1 프로의 ASP-P-니트로 아닐리드를 사용하여 이러한 점을 설명하기 위해 노력했다. 이 시약은 분열 (형광 무료 paranitroanilide 대 무료 sulphydryl) 다음과 같은 서로 다른 반응 그룹을 생성 할 수 있지만,이 단백질 분해 분열에 영향 무엇이든이 없습니다. 기술 된 프로토콜은 매우 오래 프로토콜 (18)의 현대 적응이지만 또한 GzmA 및 GzmH 다른 granzymes의 활성을 검출하기위한 방법 론적 틀을 제공하면서 조사관, 적절히 다른 GzmB 기판을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.

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프로토콜

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참고 : 마우스에서 파생 된 비장 (나이 6-10 주) 모든 동물 실험은 피터 맥 칼럼 암 센터 (E486)의 동물 윤리 지침에 따라 수행 하였다.

샘플 1. 준비.

  1. 활성화 마우스 NK 세포의 준비.
    1. 시판되는 키트를 사용하여 음성 선별에 의해 (GzmB 유전자 NULL) 마우스 - / - C57BL / 6 또는 B6.GrzmB의 비장의 단일 세포 현탁액으로부터 기본 나이브 NK 세포를 분리.
    2. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. 요약하면, 이러한 자기 T 및 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 대 식세포, 및 특정 표면 마커에 대해 바이오틴 - 컨쥬 게이트 항체를 사용하여 적혈구 세포와 같은 "비 - NK"세포를 라벨. "비 NK"세포를 고갈 방지 비오틴 구슬 자기 분리를 사용합니다.
    3. 배양은 24 웰 플레이트에서 700,000 세포 / ml에서 IL-2 (1000 U / ㎖)를 함유하는 미디어 5-7 일간 NK 세포를 격리37   ° C.
    4. 대안 적 사용은 19 T 세포, OT1 T 세포 수용체 트랜스 제닉 마우스 (20)로부터 기본 항원 제한된 CTL이 CTL 분비 GzmB (19)의 행동을 결정하기 위하여 활성화 된 NK 세포로부터 혼합 림프구 배양 물 (21), 또는 상층 액에 생성 된 활성화.
  2. 인간 NK 세포주 및 일차 NK 세포의 분리의 유지.
    1. 10 % 우태 혈청으로 보충 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 배지에서 인간 NK 백혈병 (YT 세포)를 유지한다. 또한, 정상인의 말초 혈액에서 차 NK 세포를 정화하고 이전 22 설명 된 바와 같이 IL-2 100 U / ml의에서이 함유 배지 2 ~ 3 일 동안 자극한다.
  3. 세포 용 해물의 생성.
    1. PBS (PH 7.4)에 세포를 세 번 세척 한 후 Nonidet P-40 용해 버퍼에 일시 중단 (0.1 % NP-40, 250 mM의 염화나트륨, 25 mM의 헤 페스, 2.5 mM의 EDTA). 이상적으로는, 5 × 106의 최소 용해 7 T 세포>까지. 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오, 많은는 GzmA 취소 할 수없는 세린 프로테아제 억제제, 특히 tryptases에 있습니다. 얼음에서 20 분 동안 인큐베이션 한 후 10 분간 15,000 XG에 미세 원심에서 핵 펠렛. 핵 펠렛을 취소하고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
  4. 해물의 단백질 농도를 결정합니다.
    1. 이러한 브래드 bicinchoninic 또는 산 (BCA)과 같은 선택의 시판 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. 농도가 1 ~ 2 ㎎ / ㎖ 최소 있는지 확인하십시오. 필요한 때까지 -20 ° C에서 보관 용 해물 (그랜 자임 활동은 -20 ° C에서 몇 달 동안 안정).

2. 그랜 자임 B 활동 분석

  1. 시약의 조제
    1. DMSO에 기판 (BOC-AAD-S-BZL 또는 AC-IEPD-pNA를)의 10 mM의 주식을 준비합니다 (~ 5 ㎎ / ㎖) -20 & #에서 분취에 저장176; C. 갓 작업 희석을 준비하고 BOC-AAD-S-BZL 부분적으로 DMSO에 저장에 가수 분해로, 하루 후 폐기합니다.
    2. -20 ° C에서 250 밀리미터의 DMSO 비색 시약 (5,5'- 디티 오 - 비스 (2- 니트로 벤조산), DTNB)의 재고 (0.09 g / mL) 및 저장소를 준비한다. 매일 신선한 작업 희석을 준비합니다. 이 시약은 SBzl 표시가 아닌 그룹 pNA를 가진 기판이 필요합니다.
    3. 신선한 버퍼 (0.1M HEPES, 0.05 M의 MgCl 2, pH를 7.3) 2 ~ 3 주까지합니다.
  2. 실온으로 DTNB 및 합성 기판을 준비한다. 희석 기판 (1시 16분, 예를 들어 1.6 버퍼 용액에 100 μL)과 DTNB (1 : 250, 예를 들어 10 2.5 ml의 버퍼의 μL) 잘 섞는다.
  3. 160 μL의 최종 부피 버퍼에 각 시료 100 μg의 단백질 용 해물의 최소 희석. 멀티 채널 피펫을 사용하여 ''U ''바닥 비닐 96 웰 플레이트 (~ 33.3 ㎍ / 웰) 세중 잘 당 50 μl를 추가합니다."버퍼 전용"제어를 포함 (또한 세중).
  4. AC-IEPD-pNA를 사용하여 작업 할 때 샘플 / 버퍼 제어로 희석 DTNB 100 μl를 추가합니다 (이 단계를 생략합니다.
    참고 : GzmB에 의해 AC-IEPD-pNA를의 쪼개짐 직접 형광 pNA를 (그림 4B)를 발표한다.
  5. 빨리 다음 버퍼 부정적인 컨트롤로 시작하는 예상 양의 샘플을 마무리, 삼중의 각 세트로 희석 기판의 50 μl를 추가하는 멀티 채널 피펫을 사용합니다.
  6. 플레이트 리더에서 접시를 놓습니다. OD 405 nm에서 마이크로 플레이트 리더에 BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL / AC-IEPD-pNA를 가수 분해하여 ASP를-ASE 활동을 측정한다. 25 판독, 매 15 초 (약 6 분 총 독서 시간)을 가지고, 운동 분석 프로토콜을 사용합니다.
  7. 플레이트 리더 (VMAX)의 소프트웨어에 대한 값을 생성 할 수없는 경우 직접 기판의 절단 속도를 계산하기 위해 각 시점에서 생성 흡광도 판독 값을 사용한다.

다 3. 분석타

참고 : 시간이 지남에 OD의 변화 (MOD / 분)로 정의 된 최대 속도로 제시됩니다 생성 된 데이터,.

  1. 데이터를 분석하는, 흡광도의 변화율로부터 산출되는 기판 절단의 최대 속도를 결정한다. 자동 일반적으로이 옵션이 플레이트 리더 소프트웨어를 사용하여이 작업을 수행합니다.
  2. 또는 수동으로 플레이트 리더에 운동 분석 중에 생성되는 흡광도의 변화의 운동 플롯을 본 후 가파른 직선을주는 데이터 포인트를 선택합니다. 대부분의 상기 분석 최대 레이트로는 분석의 제 2 분 이내에 달성된다.
  3. 시간 간격으로이 직선과 분열의 가장 높은 OD 독서에서 초기 OD 읽기를 뺍니다. 통계 분석 및 그래픽 디스플레이 용 Microsoft Excel / 그래프 패드에 원시 데이터를 전송합니다.

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결과

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BOC-AAD-S-BZL 기판 GzmB에 대한 특정

세린 프로테아제 GzmB 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 구성 성분이며, 바이러스 감염 또는 형질 전환 세포와 같은 표적 세포에 빠른 세포 사멸 죽음을 유도 주로 담당하고 있습니다. 이 때문에 선택된 단백질의 특정 특정 아스파 테이트 잔류 후 분열에 대한 기판 선호도에 크게이며, 속성은 아스 파르 테이트 잔류 후 절단하지만 단백질 분해 효소의 다른 클래스, 시스테인 프로테아제 가족 15 인 카스파, 공유. 단백질 분해 메카니즘의 차이는 AAD-SBzl 어떤 카스파 의해 절단 될 수 없다는 것을 의미한다. GzmB 발현은 이들 세포 (도 1)에서 제조 된 세포 용 해물에서 모니터링 될 수있다 세포 독성 림프구 및 효소 활성의 활성화 다음 유도된다. 그랜 자임 유전자 녹아웃 마우스의 가용성은 우리가를 구축 할 수있다합성 펩티드 기질...

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토론

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역사적으로 granzymes은 표적 세포의 급속한 세포 사멸 죽음을 유도 할 수있는 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 이펙터 분자로 확인되었다. 이는 아스 파르 테이트 (D) 잔기에 타깃 기판 분자를 절단함으로써 그 하류 표적 여러뿐만 아니라, 모두 절단 프로 카스파하여 카스파 제 캐스케이드를 활성화 할 수 있었다 GzmB의 작용에 주로이었다. 그러나, 지금 GzmB 발현 림프구 세포 독성 세포에 국한되지 않고 그 기능이 아니라 타겟 셀 인식 및 세포 죽음을 넘어 연장 될 수 있다는 것을 이해할 수있다.

이 논문에서 우리는 하나의 간단한 비색 분석법을 이용하여 마우스와 인간의 CTL / NK 세포 모두에서 파생 된 세포 용 해물에서 활동 GzmB의 검출을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램이 다른 소스로부터 세포 샘플에서 GzmB를 검사 할 수있는 다음과 같은 연구 결과에 의해 확인으로이 분석의 단순화와 특이도의. 그러나, 세포 용...

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft(DFG, 독일 연구 재단)로부터 MH에 대한 HA 6136/1-1 보조금을 통해 지원을 받았습니다. JAT는 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council of Australia)의 프로그램 및 프로젝트 보조금의 지원을 받습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASMSB05Granzyme B 기판 (마우스 및 인간)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Granzyme B 기판 (인간만)
N-α-CBZ-L-lysine-S-BzlSigma-AldrichC3647Granzyme A 기판
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Granzyme H 기판
5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) 시그마-알드리치D8130DTNB, 엘먼' s 시약
NK 세포 분리 키트 II 마우스Miltenyi Biotec GmbH130-096-892음성 선택 키트
NK 세포 분리 키트 humanMiltenyi Biotec GmbH130-092-657음성 선택 키트
플레이트 리더Biorad iMarkBiorad Microplate Manager 소프트웨어 버전 MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plateCorning, MA, USA2797

참고문헌

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