BOC-알라 - 알라 -의 ASP-S-BZL의 가수 분해 : 색채 특히 그랜 자임 B 단백질 분해 활동를 측정 분석

요약

우리는 인간, 마우스 또는 쥐 Granzyme B (GzmB)의 단백질 분해 활성을 구체적으로 측정하는 간단하고 정량적인 비색 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 적절한 인식 서열을 가진 다른 합성 펩타이드 기질의 가수분해에 의해 다른 과립 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 측정하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

초록

세린 프로테아제 Granzyme B(GzmB)는 세포독성 T 림프구(CTL) 또는 자연살해(NK) 세포에 의해 방출될 때 표적 세포 자멸사를 매개합니다. GzmB는 인간과 생쥐에서 가장 많이 연구된 그랜자임이므로 연구자들은 병태생리학에서 그 기능과 역할을 연구하기 위해 구체적이고 신뢰할 수 있는 도구가 필요합니다. 이는 특히 구조적 또는 기능적으로 관련된 카스파제(caspasé) 또는 다른 그랜자임(granzyme)과 같은 프로테아제를 인식하지 않는 분석을 필요로 합니다. 여기에서는 펩타이드 티오에스테르 Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl을 사용하여 비색 분석에서 아스파르트산 잔류 후 절단에 대한 GzmB의 선호를 적용합니다. GzmB는 이 기질을 절단할 수 있는 유일한 포유류 세린 프로테아제입니다. 기질은 인간, 마우스 및 쥐 GzmB에 의해 유사한 효율로 절단되며, 이는 상업적으로 이용 가능한 다른 펩타이드 기질과 공유되지 않는 특성이며, 이러한 목적에 적합한 것으로 광고되는 일부도 있습니다. 이 프로토콜은 활성화된 NK 세포 또는 CTL의 분획되지 않은 용해물을 사용하여 입증되었으며 올바른 대조군이 사용되는 경우 다양한 원핵 및 진핵 시스템에서 생성된 재조합 단백질 분해 효소에도 적합합니다. 이 분석은 포유류 림프구에서 세포독성 분자와 다양한 방법론으로 표현되는 재조합 분자의 잠재적인 세포사멸 활성을 확인하기 위한 매우 특이적인 방법입니다.

서론

Granzymes 자연 킬러 (NK) 세포 및 세포 독성 T 림프구 (CTL) ^(1)의 분비 리소좀에서 발견되는 세린 프로테아제 패밀리이다. 다섯 가지 granzymes 인간 (A, B, H, K 및 M)에 존재하고, 마우스에서 십 (A - G, K, M 및 N) ^2,3-. 그랜 자임과 그랜 자임 B (GzmA, GzmB)는 가장 풍부하고 광범위하게 인간과 설치류 설정에서 조사되었다.

GzmB의 고전 함수는 표적 세포 사이토 졸로 ^{액세스 4} 그랜 자임을 허용 기공 형성 단백질 퍼포과 함께 실행되는 표적 세포에서 아폽토시스의 유도이다. GzmB 발현 명백하게 세포 상해 성 림프구에서 발견되지만, 최근의 연구는 호염기구 ^(6), 비만 세포 ⁽⁷⁾ 형질 수지상 세포 ⁽⁸⁾ 및 B 세포 ^(9)를 포함하지만, 케 라티노 사이트 ^(5)에 한정되지 않고, 다른 GzmB 발현 세포 유형의 다양한 ^{어드레싱되었습니다 10.}이러한 맥락에서, 비 세포 사멸 GzmB 기능은 염증 과정, 조직 리모델링과 다른 면역 특성 ^11-14 참여에 이르기까지 드러났다.

프로토콜

참고 : 마우스에서 파생 된 비장 (나이 6-10 주) 모든 동물 실험은 피터 맥 칼럼 암 센터 (E486)의 동물 윤리 지침에 따라 수행 하였다.

샘플 1. 준비.

1. 활성화 마우스 NK 세포의 준비.
   1. 시판되는 키트를 사용하여 음성 선별에 의해 (GzmB 유전자 NULL) 마우스 - / - C57BL / 6 또는 B6.GrzmB의 비장의 단일 세포 현탁액으로부터 기본 나이브 NK 세포를 분리.
   2. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. 요약하면, 이러한 자기 T 및 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 대 식세포, 및 특정 표면 마커에 대해 바이오틴 - 컨쥬 게이트 항체를 사용하여 적혈구 세포와 같은 "비 - NK"세포를 라벨. "비 NK"세포를 고갈 방지 비오틴 구슬 자기 분리를 사용합니다.
   3. 배양은 24 웰 플레이트에서 700,000 세포 / ml에서 IL-2 (1000 U / ㎖)를 함유하는 미디어 5-7 일간 NK 세포를 격리37   ° C.
   4. 대안 적 사용은 ¹⁹ T 세포, OT1 T 세포 수용체 트랜스 제닉 마우스 ^{(20)로부터} 기본 항원 제한된 CTL이 CTL 분비 Gzm....

결과

BOC-AAD-S-BZL 기판 GzmB에 대한 특정

세린 프로테아제 GzmB 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 구성 성분이며, 바이러스 감염 또는 형질 전환 세포와 같은 표적 세포에 빠른 세포 사멸 죽음을 유도 주로 담당하고 있습니다. 이 때문에 선택된 단백질의 특정 특정 아스파 테이트 잔류 후 분열에 대한 기판 선호도에 크게이며, 속성은 아스 파르 테이트 잔류 후 절단하지만 단백질 분해 효소의 다른 클래스, 시스테인 프로테아제 가족 ¹⁵ 인 카스파, 공유. 단백질 분해 메카니즘의 차이는 AAD-SBzl 어떤 카스파 의해 절단 될 수 없다는 것을 의미한다. GzmB 발현은 이들 세포 (도 1)에서 제조 된 세포 용 해물에서 모니터링 될 수있다 세포 독성 림프구 및 효소 활성의 활성화 다음 유도된다. 그랜 자임 유전자 녹아웃 마우스의 가용성은 우리가를 구축 할 수있다합성 펩티드 기질.......

토론

역사적으로 granzymes은 표적 세포의 급속한 세포 사멸 죽음을 유도 할 수있는 세포 독성 림프구 (CTL 및 NK 세포)의 주요 이펙터 분자로 확인되었다. 이는 아스 파르 테이트 (D) 잔기에 타깃 기판 분자를 절단함으로써 그 하류 표적 여러뿐만 아니라, 모두 절단 프로 카스파하여 카스파 제 캐스케이드를 활성화 할 수 있었다 GzmB의 작용에 주로이었다. 그러나, 지금 GzmB 발현 림프구 세포 독성 세포에 국한되지 않고 그 기능이 아니라 타겟 셀 인식 및 세포 죽음을 넘어 연장 될 수 있다는 것을 이해할 수있다.

이 논문에서 우리는 하나의 간단한 비색 분석법을 이용하여 마우스와 인간의 CTL / NK 세포 모두에서 파생 된 세포 용 해물에서 활동 GzmB의 검출을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 응용 프로그램이 다른 소스로부터 세포 샘플에서 GzmB를 검사 할 수있는 다음과 같은 연구 결과에 의해 확인으로이 분석의 단순화와 특이도의. 그러나, 세포 용.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl	SM Biochemicals LLC, CA	SMSB05	Granzyme B 기판 (마우스 및 인간)
Ac-IEPD-pNA	SM Biochemicals LLC, CA	SMPNA009	Granzyme B 기판 (인간만)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl	Sigma-Aldrich	C3647	Granzyme A 기판
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl	SM Biochemicals LLC, CA	SB025	Granzyme H 기판
5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)	시그마-알드리치	D8130	DTNB, 엘먼' s 시약
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