여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR)는 수송의 카세트 (ABC) 상과 바인딩 ATP의 고유 채널 형성 부재이다. CFTR의 인산화 및 뉴클레오티드 종속 클로라이드 채널 활성은 전 세포 자주 시스템 및 절제된 막 패치에서 단일 채널로 검토되고있다. 많은 낭포 성 섬유증을 유발하는 돌연변이 활성이 변화하는 것으로 나타났다. 정제 프로토콜 소수 게시되었지만, 채널 활성을 유지 빠른 재구성 방법 및 정화 시스템에 인구 채널 활동을 연구하기위한 적절한 방법이 결여되어있다. 여기서 빠른 방법 규제 할라이드 채널로서의 활성을 보유 정의 지질 조성물의 테오로 정제 및 전장 CFTR 단백질의 기능적 재구성을 위해 설명된다. 함께 채널 활성의 신규 한 플럭스 계 분석법이 재구성 방법에 적합한 시스템이다야생형 CFTR의 인구 채널 특성 및 질병을 일으키는 돌연변이 F508del- 및 G551D-CFTR 공부. 구체적으로, 상기 방법은 인산화, 뉴클레오티드 및 CFTR 채널 활동에 강화제와 같은 작은 분자 억제제의 직접적인 영향을 연구하는 유틸리티를 갖는다. 방법은 또한 음이온 기판 다른 막 채널 / 수송의 연구 의무가 있습니다.
서론
폐, 대장, 췌장 및 땀 분비 등의 조직에서 상피 세포의 세포막에 걸쳐 염화 수송은 주로 ABC의 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 레귤레이터 (CFTR), ATP- 인산화 조절 부재 (ATP-에 의해 매개된다 검토 한 막 단백질의 카세트) C 아과 ()를 바인딩. ABCC 서브 패밀리의 다른 구성원과 마찬가지로, CFTR는 뉴클레오티드 결합 도메인은 단일에 적당한 ATP 아제 활성을 갖는다 (NBDs)의 계면에서 형성된 2 개의 뉴클레오티드 결합 부위에서 ATP 결합 큰, 멀티 - 스패닝 막 관통 단백질 인 사이트. 그러나 다른 ABCC 아과 멤버는 달리, CFTR는 고유의 규제 CL 채널로보다는 활성 용질 수송로 진화하고있다.
morbi로 이어지는 CFTR 원인 낭포 성 섬유증, 폐, 위장관, 췌장 및 생식 기관을 포함한 여러 장기에 영향을 미치는 질병의 돌연변이,젊은 성인에서 dity과 사망률. 폐 질환은 일반적으로 전도성의기도 상피 표면에 CFTR 기능의 손실에 의해 발생 낭포 성 섬유증의 조기 사망에 대해 대부분의 경우에 차지한다. 호흡 섬모 상피의 선 단면 상에 유체 층을 수정 상피 표면을 가로 질러 물 운동 - CFTR 클로라이드 채널 활동의 부족 모두 CL의 감소를 야기한다. 이는 호....
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프로토콜
CFTR 1. 정제
참고 :이 프로토콜에 사용되는 장비 및 재료의 목록은 재료 표 및 장비를 참조하십시오. 상세한 프로토콜은 S F 9의 바쿨로 바이러스 발현 계에서 인간 17,28 WT-CFTR의 과발현 돌연변이 체에 대한 필요성이 존재한다. CFTR 과발현이 프로토콜에 따라 S f를 9 세포의 알약을 준비합니다.
- 원유 막 준비
- 신선한를 구하거나 표준 세포 배양 방법에 의해 성장, 과발현 C- 말단 그의 10 -tag와 wildtype-, F508del-, 또는 G551D-CFTR 단백질을 세포의 500ml의 문화에서 냉동 S F 9 세포 펠렛을 해동, 로 이전 17,28 설명했다. 세포 펠릿을 약 5 ml의 부피와 약 5g의 습윤 중량을 가질 것이다.
- 재현 탁의 S f를 보장 4 ° C에서 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 인산염 완충 생리 식염수 20 ㎖ (PBS)의 pH 7.4 (1 태블릿 50 mL 당) 9 셀,샘플은 시각적으로 균일 나타나고 세포의 어떤 덩어리가 남아 있지.
- 통로 당 2 분 동안 10,000 PSI (바람직하게는 15,00....
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결과
이 기록 문서에 설명은, 정화 재구성 및 CFTR 단백질의 조절 채널 활동을 측정하는 방법이 있습니다. 1a는 정제, 재구성 및 요오드화 유출 절차에 대한 워크 플로우를 보여줍니다. 요오드화 플럭스에 의해 재구성 된 채널 활동 및 측정을위한 방법이 또한 관련 영상보다 상세히 도시되어있다.
테오에 CFTR의 정제 및 재구성
CFTR 기능적 S f를 높은 수준에서 중량 또는 돌연변이 CFTR의 cDNA (2)를 포함하는 재조합 배큘로 바이러스를 사용하여 9 세포를 표현할 수있다. 하지 포유류 발현 시스템이지만, CFTR 표현의 수준을 높일 수 S F 9의 세포를 바쿨로 바이러스 발현 시스템을 사용 하였다. CFTR 생산은 총 세포 단백질 17,28 1 %만큼 높을 수있다. 바쿨로 바이러스 시스템 9.......
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토론
셀룰러 과발현 다양한 시스템에서, 전체 길이, 작용 성 CFTR 분리 정제를위한 프로토콜의 수가 제한되어왔다. 이 ATP 아제와 평면 이중층 단일 채널 측정을 포함한 채널 기능의 직접 측정을 포함하여 분석에 매우 기능적인 WT-CFTR 또는 적당한 양의 F508del- 및 G551D-CFTR의 높은 농축의 신속한 정화이 허용 여기에 설명 된 방법이 유리하다 작은 분자 19-21의 연구 관련성이 높은 시스템과 CFTR 인구 채널 기능의 시연 측정합니다. 정제 방법은 신속하고 효율적인 재구성 프로토콜에 통합되어, 그러나 다른 방법에서 정제 된 단백질은 물론이 재구성 프로토콜에 연결된 정화 세제 마찬가지로 제거 의무로되어 제공 될 수있다.
EXC에서 복잡하고 힘든 단일 채널 실험 달리에 다루지 막 패치는, 여기에 기재된 방법은 CFTR 채널 기능의 강력하면서도 간단 평가를 허용하고, 고유이 측정 CFTR 채널보다는 하나 또는 몇 분자의 큰 모집단의 기능을보고한다.......
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공개 사항
저자는 여기에 설명 된 정제 방법의 개발 과정에서 박사 Mohabir Ramjeesingh의 조언을 인정합니다. 이 연구는 건강 연구 (CIHR)과 낭성 섬유증 캐나다 (CFC)의 캐나다 연구소에서 CEB에 운영 보조금에 의해 지원되었다. PDWE는 CIHR 및 CFC를 통해 친목 상에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 낭포 성 섬유증 재단 치료학 (CFFT)에 의해 보정, 강화제 박사 R. 교량 (의학 로잘린 대학과 과학)에서 억제제 화합물 및 유통의 제공을 인정합니다. 저자는 또한 배큘로 바이러스 시스템을 사용하여 중량 및 돌연변이 CFTR 단백질을 발현의 베일러 세포 배양 시설 (NIH 보조금 P30의 CA125123)에 의해 우수한 서비스를 인정합니다. 비활성 VX-770 아날로그, V-09-1188은, 버텍스 제약의 선물했다.
감사의 글
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| fos-choline 14 세제 | Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com) | F312 | Affymetrix: Anatrace 제품; CAS# :77733-28-9 |
| cOmplete EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | Roche (www.roche-applied-science.com) | 04 693 132 001 | EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (1/50 ml 또는 mini: 1/10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; 참조: 11873 580 001) |
| cOmplete ULTRA 정제, 미니, EDTA-free, EASYpack | Roche (www.roche-applied-science.com) | 05 892 791 001 | |
| Ni-NTA Agarose | Qaigen GmbH | 1018240 | |
| Fisherbrand 스크리닝 컬럼 | Fisher Healthcare | 11-387-50 | |
| Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K | Millipore (www.millipore.com) | UFC910008 | |
| cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit | New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit) | Peirce PKA도 적합합니다 | |
| PC, 닭고기 달걀 | Avanti 극지 지질 (www.avantilipids.com) | 840051C | |
| POPC | , Avanti 극지 지질(www.avantilipids.com) | 850457C | |
| PS, 돼지 뇌 | Avanti 극지 지질(www.avantilipids.com) | 840032C | CFTR은 Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC 또는 PE:PS:PC:에르고스테롤, 5:2:2:1 (w/w) |
| PE, 닭고기 달걀 | Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com) | 841118C | |
| Ergosterol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 45480 | |
| Pierce Detergent 제거 스핀 컬럼 | Thermo Scientific | 87779 | 1 ml 용량 컬럼 |
| valinomycin | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | V-0627 | |
| VX-770 (ivacaftor) | Selleck Chemicals | S1144 | |
| 요오드화물 선택적 미세전극 | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam) | LIS-146ICM | |
| [header] | |||
| Clampex 8.1 소프트웨어 | Axon Instruments (www.axon.com) | 우리는 ClampX 시스템의 구성 요소와 집에서 만든 필터를 사용하여 전극에 대한 반응을 모니터링하고 기록합니다 | |
| 대체 소프트웨어: ArrowLabb 시스템 | Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam) | LIS-146LICM-XS | Lazar Research는 프로브 응답을 기록하기 위해 컴퓨터 및 소프트웨어와 인터페이스할 수 있는 미터를 판매합니다. 이 소프트웨어는 설정과 유사한 기능을 제공해야 합니다. |
| 작은 교반 막대 | Big Science Inc (www.stirbars.com) | SBM-0502-CMB | |
| Sonicator | Laboratory Supplies Co, Inc. | G112SP1G | 다른 제조업체의 Bath 초음파 발생기도 적합해야 합니다 |
참고문헌
- Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy. Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).
- Bear, C. E., et al.
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