마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
2광자(2P) 현미경은 살아 있고 손상되지 않은 조직 내부의 깊은 곳에서 세포 역학과 상호 작용을 밝히는 데 사용됩니다. 여기에서는 쥐의 척수에서 살아있는 세포를 촬영하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 신경염증성 탈수초성 장애를 겪고 있는 척수에 이식한 후 신경 전구 세포(NPC) 역학을 분석하는 데 매우 적합합니다. NPC는 축삭 손상 부위로 이동하고, 증식하고, 희소돌기아교세포로 분화하고, 직접 재수초화에 참여합니다. 따라서 NPC는 만성 탈수초성 질환을 개선할 수 있는 유망한 치료법입니다. 이식된 NPC는 척수의 복부 쪽의 손상된 부위로 이동하기 때문에 기존의 생체 내 2P 이미징은 불가능하며 이전에는 조직화학적 염색 접근 방식을 사용하여 정적 상호 작용에 대한 정보만 사용할 수 있었습니다. 이 방법은 복부 척수에 이식된 NPC를 이미지화하기 위해 생성되었지만, 전체 척수에 걸쳐 이식된 세포와 내인성 세포에 대한 수많은 연구에 적용할 수 있습니다. 이 기사에서는 향상된 노란색 형광 단백질 발현 축삭돌기와 향상된 녹색 형광 단백질 발현 이식된 NPC를 사용하여 척수의 준비 및 이미징을 보여줍니다.
서론
실험자가 면역 뇌척수염 (EAE) 및 neuroadapted 마우스 형 간염 바이러스 (MHV)과 두개 내 감염을 포함하여 탈수 초화의 마우스 모델은, 분자 경로 및 질병과 관련된 세포의 상호 작용을 연구하는 훌륭한 도구입니다. 그들은 주도하고 FDA의 효과는 주로자가 면역 및 염증 일의 중단을 대상으로, 제약 요법을 승인 지원했다. 내생 재유 수화가 실패하지만 일단, 현재 승인 된 치료는 효과적으로 중추 신경계의 탈수 초 병변을 복구하지 않습니다. 따라서, 질병의이 단계에서 복구에 초점을 맞춘 치료는 만성 증상과 삶의 질 향상 등의 개선을 위해 중요하다. 최근, 신경 전구 세포 (NPC들)은 염증과 탈수 초화의 영역을 대상으로 잠재적 인 재생 치료 양상으로 최전선에왔다. 몇몇 연구 endogeno을 유도하는 능력의 NPC를 강조우리는 재유 수화 및 재유 수화 2-8에 직접 참여한다. NPC의 재유 수화가 직접 관여되어 있기 때문에, 다음과 같은 내인성 세포 이식 그들의 동력학 및 상호 작용을 이해하는 것이 필수적이다. 이식 후, NPC가 다음 rostrally 및 이식 사이트 5,9에 꼬리 쪽 상대 백질 손상의 영역에 배쪽으로 이동한다. 이주의 반응 속도는 환경 단서에 대한 응답에 차이가; 비 손상된 척수에 이식 NPC가 손상된 ....
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프로토콜
참고 : 윤리 문 : 동물 처리를위한 프로토콜은 캘리포니아, 얼바인, 프로토콜 # 2010년부터 2943년까지 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.
척수 1. 제거
- 챔버를 안락사에 ~ 100 % 액체 이소 플루 란, USP 적신 종이 타월을 놓고 위에 마른 종이 타월을 배치합니다. 마우스가 이소 플루 란 접촉되지 않도록 마른 종이 타월 위에 챔버에 마우스를 놓고 챔버가 포함되어 있는지 확인합니다. 마우스가 안락사 될 수 있도록 호흡 중단 후, 1 분 정도 기다립니다.
- 마우스를 안락사 보장하기 위해 목의 척추 절개를 수행합니다. 이 척수에 손상을 줄 수 있습니다 자궁 경부 전위를 수행하지 마십시오.
- 젖은 모발, 70 % 에탄올로 마우스 스프레이.
- (약 자궁 얇은 판 1에서 척추를 노출 C1를 마우스의 뒷면에서 머리와 피부를 제거하는 날카로운 미세 가위를 사용하여) 성례의 얇은 판 4 (S4)에.
- # 10 메스 블레이드를 사용하여, 근육과 지방에서 분리하는 척주의 왼쪽과 오른쪽을 절개. 이 척수의 제거가 훨씬 쉽게 만들 것입니다.
- 옵션 : 곡선 루어 rongeurs 추가 살을 멀리 퍼하는 데 사용할 수....
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결과
외식 척수 촬상 프로토콜 척수 내의 형광을 시각화하는데 이용 될 수 있지만, 우리는 대표적인 결과 EYFP-축삭-eGFP는 NPC와 상호 작용을 보여준다. 첫째, 우리는 그림 1A에 포함 된 복부 척수 준비를 보여줍니다. 다음으로, 우리는 그림 1B에서 2P 현미경 설정 및 주요 구성 요소를 보여줍니다. (2) 복부 척수 내에서 단일 Z-스택에 eGFP는 및 EYFP 형광을 보여줍니다. 연속 Z - 스택의 취득은 그대로 조직 내에서 실시간으로 세포 역학을 분석하는 시간 경과 비디오를 생성하기 위해 컴파일 할 수 있습니다. 520 nm의 단일 에지 이색 및 560 nm의 단일 에지 이색 성 빔 스플리터를 사용하여 프로토콜에 명시된 바와 같이, 및 eGFP는 EYFP 신호를 분리 할 수있다. 개별 채널은 녹색과 노란색 사용 이미징 소프트웨어를 모조 할 수 있습니다.
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토론
실시간은 그대로 조직의 2P 영상은 탈수 초 마우스 척수에 이식 다음 NPC의 반응 속도 및 상호 작용을 조사하기 위해 필요합니다. 생체 내에 2P 촬상 일반적 살아있는 쥐 척수의 등쪽에 휴대 동성을 결정하는 데 사용되며, 탈수 초성 질환 17-19에서 척수 탈수 초를 연구하기 위해 사용되었다. 이식의 NPC가 2P 현미경을 사용하여 현장에서 이미지에 너무 깊이 자리 잡고 복부 백질로 이동하기 때문에, 생체 준비가 필요하다. 이 방법론은 손상 및 비 손상 척수 6 이식의 NPC의 운동성 및 재유 수화 반응 속도를 결정하기 위해 우리의 실험실에서 사용되어왔다. 생체 내 준비뿐만 아니라 세로 방향으로 척수의 검색을 사용뿐만 아니라 가로 방향으로 복부 측면 6,20에서 . 이 t에서 세포 이동의 차이 (속도와 방향)과의 상호 작용 분석을 위해 수 있습니다이식 사이트에 인접하고, 이식 사이트 (6)에서 다양한 거리에서 ran.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작업은 미국 국립보건원(NIH) 보조금 R01 GM-41514(M.D.C.), R39 GM-048071(I.P.), R01 NS-074987(T.E.L.) 및 국립다발성 경화증학회(NMSS) 협력 센터 연구상 CA1058-A-8(C.M.W., T.E.L. 및 M.D.C.), NMSS 보조금 RG4925, NIH 교육 보조금 T32-AI-060573(M.L.G.), NMSS 박사후 연구원 FG 1960-A-1(J.G.W.에게) 및 George E. Hewitt Foundation for Medical Research(M.P.M.)의 자금 지원.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| 파인 가위 | 파인 사이언스 툴 | 14060-09 | 날카로운 |
| 메스 블레이드 #10 | 파인 사이언스 도구 | 10010-00 | |
| 메스 핸들 | 파인 사이언스 툴 | 10003-12 | |
| 루어 롱거스 | 파인 사이언스 툴 | 16001-15 | |
| 그레이프 겸자 | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas 가위 | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| 메스 블레이드 #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| 아가로스, 저겔화 온도 | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (조직 접착제) | 3M | 1469SB | |
| 22mm 사각 커버 슬립 | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X 디핑 대물, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| 단일 인라인 솔루션 히터 | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm 단일 가장자리 이색성 빔 스플리터 | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm 단일 가장자리 이색성 빔 스플리터 | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| 광전자 증배관 | Hamamatsu | R928 | |
| C/L 가변 속도 튜빙 펌프 | Masterflex | 77122-22 | |
| 디지털 온도계 | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 소프트웨어 | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 소프트웨어 | Bitplane | N/A |
참고문헌
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G.
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